临床上周围神经损伤的致残率高，严重影响患者生活质量，给患者家庭乃至整个社会带来较大的经济负担，神经缺损后的再生与修复一直是国内外神经科学基础与临床应用研究的重点之一。近年来，随着组织工程技术的不断进步，运用组织工程化周围神经（tissue engineered peripheral nerve，TEPN）修复神经损伤成为一种极具发展前景的治疗策略而备受关注。组织工程学的三大要素是：种子细胞、支架材料和细胞外基质。种子细胞是组织工程化神经能否成功修复缺损的关键，常用的主要是周围神经系统胶质细胞—雪旺细胞（Schwann cells，SCs）及能向其分化的干细胞如骨髓间充质干细胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）等。然而，由于雪旺细胞分离培养困难、增殖速度慢等原因限制了其在周围神经修复中的临床应用。BMSCs不仅能够向多种组织和细胞类型分化，并且在体外易分离、培养和扩增。这种解决雪旺细胞来源问题的新途径，已经日渐成为研究的热点。总结目前运用干细胞修复周围神经损伤的研究现状，我们发现在BMSCs的提取、纯化，以及诱导BMSCs向类雪旺细胞分化的诱导剂配伍比例等方面仍有许多问题尚未解决。微流控芯片所具有的不同操作单元灵活组合、整体可控和规模集成的特点在用于细胞研究的过程中表现出极大的优势。有关细胞分选、培养、分化等与细胞研究直接相关的核心技术都可在芯片上完成。此外，芯片制作成本低，并有可能实现仪器的小型化、集成化、自动化和便携化。目前国内外对于运用微流控芯片分选BMSCs并诱导其向类雪旺细胞分化的研究尚属空白。为解决上述问题，本研究首次通过创建微流控芯片平台对BMSCs的提取、纯化及诱导分化进行了如下三个部分研究：（1）构建电磁分选微流控芯片分选BMSCs。（2）构建浓度梯度微流控芯片高通量筛选BMSCs向类雪旺细胞分化的最佳诱导剂配伍比例。（3）检测优化诱导后的类雪旺细胞促进轴突再生的功能学表现。第一部分:构建电磁分选微流控芯片分选BMSCs目的：设计并构建电磁分选微流控芯片，对磁珠标记的细胞进行高通量分选，测试其细胞分选效率。将新鲜提取的大鼠骨髓单核细胞通过该芯片进行干细胞分选，检测获得的BMSCs的纯度以及增殖能力和分化潜能。方法：结合流式细胞术和免疫磁珠法分离干细胞的原理设计并构建出电磁分选微流控芯片。将已知数量的白细胞和SK-BR-3乳腺癌细胞的混合液与抗鼠CD45免疫磁珠共同孵育，使白细胞与磁珠相结合。细胞混合液在不同的注入速度下经电磁分选芯片进行细胞分选。通过流式细胞术对细胞分选前后白细胞数量的变化进行定量分析来检测磁性细胞筛出率，从而选出细胞筛出率最高的细胞注入速度。将新鲜提取的大鼠骨髓单核细胞，与抗鼠CD45免疫磁珠孵育，经电磁分选微流控芯片分选去除掉CD45+的骨髓造血干细胞，将剩余细胞与抗鼠CD271免疫磁珠孵育，经芯片分选出CD271+的BMSCs。对分选获得的CD271＋、CD45﹣细胞进行计数，取一部分细胞经流式细胞仪进行免疫表型及细胞纯度测定，另一部分细胞接种于培养瓶中进行扩增及传代培养，并进行多向分化鉴定。结果：不同细胞注入速度下电磁分选芯片的细胞筛出率显示，在液体流速较低时，磁性细胞筛出率随着流速增高而增大。当流速达到4.0mL/h时筛出率最大，为(92.54±3.33)％，此后流速增高会使磁性细胞检出率越来越低。骨髓单核细胞经电磁分选微流控芯片进行干细胞分选后获得的细胞通过流式细胞术进行干细胞的纯度鉴定，检测结果表明：具有CD29表型的细胞占99.17％，具有CD90表型的细胞占98.95％，具有CD45表型的细胞仅占0.76％。分选出的BMSCs经多向分化诱导后可分化成软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞。结论：1.通过自主研发的电磁分选微流控芯片可对磁珠标记的细胞进行高通量分选，细胞分选速度可达4.0mL/h，细胞筛出率可达(92.54±3.33)％。2.通过电磁分选微流控芯片对骨髓单核细胞进行分选，可获得高纯度的原代BMSCs，且具有较强的增殖能力和分化潜能。第二部分:构建浓度梯度芯片诱导BMSCs向类雪旺细胞分化目的：通过构建浓度梯度微流控芯片筛选出BMSCs诱导分化为雪旺细胞的最佳条件以及各种诱导因子的最佳配伍比例。方法：我们设计了一种能够产生连续浓度梯度的用于细胞化学刺激的微流控芯片。该芯片由上游的浓度梯度生成器（CGG）和下游的细胞培养模块组成。当注射泵同时驱动两种不同的刺激因子进入芯片时，两种刺激因子可以通过CGG中的弯道达到多次的混合、分离、稀释，从而在芯片下游的细胞培养微室中形成连续的浓度梯度。在芯片的细胞培养微室中种植BMSCs（103左右），向芯片的两个入口分别泵入浓度为9.00μM的福司柯林（FSK）和450.00ng/mL的β-Heregulin（HRG）。BMSCs在FSK和HRG的组合浓度梯度下诱导11天后，在芯片上行雪旺细胞标记物S100β和p75NTR的免疫细胞化学分析。观察到S100β和p75NTR阳性细胞数量最多和荧光灰度最强的细胞微室对应的诱导因子浓度即为诱导剂的最佳配伍浓度。结果：BMSCs在芯片上连续诱导11d后，其形态由原来单层生长的扁平样细胞转变为与雪旺细胞形态一致的双极、纺锤样细胞。通过在芯片行雪旺细胞标记物的免疫细胞化学染色分析得出，在4.00μM FSK和250.00ng/mL HRG的配伍比例下培养微室中表达S100β和p75NTR的免疫阳性细胞数量最多且表达的灰度值最强。结论：1.构建了一种能生成连续浓度梯度的微流控芯片，并且成功的在芯片上将BMSCs诱导成类雪旺细胞。2.通过该芯片筛选出了BMSCs向类雪旺细胞诱导的最佳诱导剂配伍比例，同时避免了大量的重复试验。第三部分：优化诱导后的类雪旺细胞促进轴突再生的功能学研究目的：通过建立大鼠脊髓背根神经元（DRG）共培养系统以及检测相关神经营养因子基因表达及蛋白分泌的水平，来评估优化诱导后的类雪旺细胞促进轴突再生的能力。方法：将相同数量的未分化的BMSCs（A组）、传统诱导剂配伍浓度下诱导的类雪旺细胞（B组）、最佳诱导剂配伍浓度下诱导的类雪旺细胞（C组）以及正常雪旺细胞（D组）分别与DRG在Transwell小室中共培养24小时，并对DRG轴突标记物βⅢ微管蛋白进行免疫细胞化学分析，从而评估各组细胞对轴突生长的影响。通过RT-PCR法及ELISA双夹心法分析上述4组细胞神经营养因子基于表达及蛋白分泌的水平，探讨其影响轴突再生的机制。结果：C组细胞相比A组和B组细胞更能促进DRG的轴突出芽和延伸，且突触密度明显增高（P<0.01），其促进轴突再生的能力更接近于正常雪旺细胞（D组）。RT-PCR结果表明，C组细胞雪旺细胞标记物（S100β，p75NTR）和神经营养因子（BDNF, NGF和NT-3）mRNA的表达水平均强于A组和B组细，上述细胞因子的表达水平已接近正常雪旺细胞（D组）。ELISA法定量分析表明，C组细胞分泌神经营养因子BDNF、 NGF和NT-3的水平明显高于A组和B组细胞（P<0.05），其分泌BDNF的水平甚至要高于正常雪旺细胞。结论：1.优化诱导后的类雪旺细胞促进轴突再生的能力更接近于正常雪旺细胞。2.这种促进轴突再生的能力与其能表达和分泌更多的神经营养因子如BDNF、NGF和NT-3等有关。