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新城疫（Newcastle disease, ND）俗称伪鸡瘟，国际兽医局（OIE）将此列为必报传染病，其主要病变特征是禽类呼吸道与消化道黏膜出血。对于该病的防控目前主要依靠疫苗免疫，传统灭活疫苗与弱毒疫苗虽然可以有效预防该病，但还不能完全控制该病的发生。目前流行于我国的新城疫病毒（NDV）亚型主要是基因VII型，传统疫苗对该亚型NDV保护效果并不理想，所以研究与创制新型的疫苗具有重要的意义。DNA疫苗具有安全、稳定、不受母源抗体干扰等优点，利用减毒沙门氏菌作为新型DNA疫苗的载体具有很好的研究潜质和应用前景，延迟裂解型沙门氏菌载体是一种具备阿拉伯糖生长依赖性的沙门氏菌载体具有其它型沙门菌无法比拟的优势，又由于其不含抗生素标记，避免了抗生素转移的可能性。在实验室前期工作的基础上针对VII型NDV的DNA疫苗，本实验设计利用融合PCR方法将NDV的主要保护性抗原F、HN蛋白基因相连接，并选择延迟裂解性沙门菌作为外原蛋白的递送载体，构建共表达基因VII型新城疫病毒F、HN双抗原的减毒沙门菌并对其进行免疫效果初步评价。具体研究内容及结果如下： （1）重组沙门菌χ11218（pYA4545-pUC-F-HN-opt-Flag）的制备及抗原性分析 本实验通过融合PCR技术、基因酶切与连接、质粒的转化及阳性菌落的筛选鉴定等方法制备并检验了重组质粒pYA4545-pUC-F-HN-opt-Flag，进而将重组质粒瞬时转染293T细胞，通过Western blot方法与间接免疫荧光技术进行检测，实验结果表明F、HN蛋白成功表达并具有抗原性。进一步通过电转化方式将重组质粒转入沙门菌χ11218受体菌株中，获得了重组沙门菌χ11218（pYA4545-pUC-F-HN-opt-Flag）阳性菌株，为下一步免疫实验效果评价提供基础。 （2）重组沙门菌χ11218（pYA4545-pUC-F-HN-opt-Flag）动物实验 本实验将刚孵化（0日龄）雏鸡随机分成4组，每组20只。分别口服免疫重组菌χ11218 （pYA4545-pUC-F-HN-opt-Flag）和空载体对照组χ11218（pYA4545），同时设立生理盐水对照组和灭活疫苗对照组，免疫程序包括初次免疫与两次加强免疫;4日龄雏鸡进行初次免疫，此后每间隔14天进行一次加强免疫，共进行两次（免疫剂量：5×108CFU/只）。 在第一次加强免疫14天后收集雏鸡外周血、脾脏、法氏囊和肠道灌洗液，通过流式细胞术和淋巴细胞增殖试验对各组雏鸡外周血中T淋巴细胞与B淋巴细胞的活化与增殖情况进行检测并利用间接ELISA方法对雏鸡血清中特异性IgY与肠道灌洗液特异性IgA水平进行检测。第二次加强免疫后14天，各组雏鸡通过滴鼻方式感染新城疫病毒（感染剂量：105EID50），攻毒后观察雏鸡精神状态、记录体重变化并统计死亡率。攻毒10天后宰杀雏鸡，收取肺脏与胸腺样本做病理切片。 实验结果显示口服免疫重组沙门菌χ11218（pYA4545-pUC-F-HN-opt-Flag）后雏鸡外周血中T淋巴细胞与B淋巴细胞数量与口服生理盐水组相比，实验组显著增多（P<0.05）。免疫重组沙门菌雏鸡血清与肠道灌洗液中 NDV 特异性抗体水平较生理盐水组显著升高（P<0.001）。攻毒后比较各组雏鸡精神状态发现初期各攻毒实验组中均有雏鸡出现站立不稳、羽毛松乱等现象。雏鸡整体采食量下降，精神状态萎靡不振，个别呈现昏睡状态。体重变化结果显示灭活疫苗组与χ11218（pYA4545-pUC-F-HN-opt-Flag）组雏鸡体重于开始阶段持续下降，于第5天左右达到最低，后逐渐呈现平稳上升趋势。χ11218（pYA4545）组与生理盐水组雏鸡体重持续下降，χ11218（pYA4545）组略优于生理盐水组。生存曲线结果显示，灭活疫苗组存活率最高为 90%，重组的沙门菌 pYA4545-pUC-F-HN-opt-Flag组存活率为50%，pYA4545组及生理盐水组均为20%。各组雏鸡肺脏与胸腺病理切片的HE染色结果显示χ11218（pYA4545-pUC-F-HN-opt-Flag）组、灭活疫苗组病理变化较轻，其余两组均有较为严重的病理损伤。 综合以上实验结果重组沙门菌χ11218（pYA4545-pUC-F-HN-opt-Flag）对新城疫病毒感染具有一定的保护作用。