肝功能衰竭是多种因素引起的严重肝功能损害,现有的病因治疗及一般支持治疗疗效甚微,病死率高达80%。目前肝移植被认为是急慢性肝功能衰竭晚期最有效的治疗方法,但是肝移植存在供体严重不足、手术复杂风险大、患者需要终身免疫抑制治疗及费用昂贵等缺点,导致众多患者在等待供肝期间死亡。而生物人工肝支持系统(Bioatificial liver support system, BLASS)的发展为肝功能衰竭的治疗开辟了新的途径：一方面部分患者急性肝功能衰竭是可逆的,通过BLASS短期有效的肝功能支持,患者肝脏可望通过残存的正常肝细胞代偿增生而恢复功能；另一方面对于不可逆的急慢性肝功能衰竭患者,也可以通过BLASS的体外肝功能支持,为最终的肝移植赢得宝贵的待肝时间,BLASS起到了“肝功能衰竭-肝移植”的桥梁作用。目前作为BLASS生物材料的体外培养的肝细胞需要达到以下3方面的要求：①质量(Quality)要求：肝细胞应具备体内肝细胞清除毒素、生物转化及合成、分泌等主要功能。②数量(Quantity)要求：肝细胞数量至少达到109个数量级,才能达到BLASS的临床支持要求。③快速临床应用(Ready to use)要求：临床上各种原因引起的肝功能衰竭患者,往往病情危重,必须短时间内获得大量的肝细胞用于BLASS体外肝功能支持治疗。因此获得大量功能好的肝细胞是BLASS的核心,是制约BLASS临床广泛应用的瓶颈。所以探索出一种实用可靠的低温保存体系,建立一个随时可用的(Ready to use)肝细胞库,是BLASS技术普遍推广的基础。温度是影响低温保存效果的关键因素：一般而言温度越低,细胞的代谢活性就越低,保存时间就越长。零下非结冰温度(Subzero nonfreezing temperature, SZNFT)是指0℃到某溶液冰点之间的温度范围,一方面可以使代谢降至最低,不同于常规低温保存(4℃及0℃),另一方面可以避免“冰晶形成”、“渗透性休克”等深低温冻存损伤,理论上SZNFT是一种理想的细胞保存形式。SZNFT最早用于供肝的保存,使供肝的保存时间明显延长,但供肝的保存混杂有缺血再灌注损伤的影响,不能完全反应对肝细胞的保存效果。目前SZNFT对永生化肝细胞的保存效果仍然不明确。因此,本文将在第一部分用UW液SZNFT(-0.8℃)保存L02永生化肝细胞,同常规低温(4℃及0℃)比较,以明确SZNFT保存肝细胞的效果。BLASS所用肝细胞来源至今尚未得到满意解决。C3A是一种人源性永生化肿瘤细胞,具有良好的增殖活性及肝细胞特异功能,如分泌ALB,尿素合成与糖原合成等。L02肝细胞是国内使用正常人肝细胞筛选出的一种永生化肝细胞株,具备氨基清除及分泌白蛋白等功能,增殖迅速且传代稳定。有关C3A与L02肝细胞SZNFT保存后生物学特性变化及其差异尚不明确。因此,本研究将在第二部分用UW液SZNFT(-0.8℃)保存C3A与L02肝细胞,以比较低温保存后C3A与L02细胞的生物学特性变化及其BLASS应用倾向性。UW液(University of Wisconsin solution)目前被认为是供肝保存的标准液,随着生物人工肝的发展,对肝细胞的需求明显增加,UW液也被用于肝细胞的短期低温保存且效果明显,但UW液费用昂贵,很多成份难以获得。费用较便宜的Celsior液(Celsior solution)和HTK(Histidine-tryptophan-ketoglutarate solution)液也被用于供肝保存的研究,以期待获得同UW液相同的效果。但UW液Celsior液和HTK液SZNFT(-0.8℃)保存人源性永生化肝细胞有无差别未见报道。因此,本文将在第三部分分别采用UW液、Celsior液和HTK液零下非结冰保存生物人工肝用L02细胞72h,以比较其保存效果有无差别并探讨其中可能的机制。研究发现细胞凋亡是除了坏死之外肝细胞冻存死亡的一个重要的途径,但低温保存引起细胞凋亡的具体机制仍然不清楚。Bcl-2/Bax蛋白家族是位于线粒体膜上通过调节线粒体非渗透性转换孔的开放及细胞色素C的释放抑制或者促进细胞凋亡的发生发展(Bcl-2可通过不同途径抑制凋亡的发生,Bax则促进凋亡的发生),因此Bcl-2/Bax比值是衡量细胞凋亡指数的一个重要指标。目前有关SZNFT(-0.8℃)保存肝细胞时Bcl-2/Bax基因及蛋白表达仍然不明确。因此本文将在第四部分分别采用SZNFT(-0.8℃)、4℃及0℃保存L-02细胞,以明确Bcl-2/Bax基因和蛋白表达同低温保存引起细胞凋亡的关系,探索低温保存引起细胞凋亡的可能机制。第一部分永生化肝细胞零下非结冰保存的效果目的体外培养永生化L02细胞,制备成细胞悬液,UW液零下非结冰(-0.8℃)及常规低温(4℃及0℃)分别保存24h、48h及72h,以探索零下非结冰保存肝细胞的效果以及同细胞凋亡的关系。方法1、细胞培养及细胞悬液制备：从液氮中取出冻存的L02细胞,迅速投入37℃水浴箱中,待其完全溶解后转入超净台内进行操作。①严格按照无菌操作方法进行,接种到50mL培养瓶。所用基础培养基为DMEM/F-12,同时添加EGF20ng/ml,胰岛素10mg/L,青霉素10kU/L,链霉素10g/L,100mL/L的胎牛血清(FBS)。②将培养瓶置于37℃,50mL/LCO2,100%湿度的培养箱内培养。③倒置显微镜观察80%以上细胞贴壁后换液1次,以后每24h换液1次,直至内壁长满。④取内壁长满的一瓶细胞,吸除培养液,加0.25%胰酶1mL,于室温消化1-3min,同时观察细胞形态,一旦发现胞质回缩细胞间隙增大,即刻吸除胰酶,终止消化。⑤加2mL含10%FBS的DMEM/F-12培养液,用吸管反复吹打内壁,使细胞完全脱离瓶壁。⑥将同批多瓶L02细胞悬液混合,取一滴至血细胞计数板,计算细胞细胞密度,最终将细胞浓度调至1×109个/L,分装至2mL冻存管。2、细胞低温保存、分组及复温方式：①分装的2ml冻存管,1000 r/min,禺心2min,将含100 mL/L FBS的DMEM/F-12培养液置换为2 mL UW液,混匀。分别至-0.8℃、0℃及4℃低温保存,即实验分为3组：-0.8℃组(零下非结冰组)、0℃组(零度非结冰组)及4℃组(对照组),每组18个标本。②低温保存24h、48h及72h后,各组均取6个标本,采用快速复温法,放入37℃水浴中震荡1-2min。③复温后的标本1000r/min,离心2min,将UW液置换为含100 mL/LFBS的DMEM/F-12培养液2mL,混匀,于37℃,50mL/LCO2,100%湿度的培养箱内培养30min。3、低温保存复温后各指标测定概括：(1)取L02细胞悬液1ml,加入到1ml含4mmol/L氯化铵及100 mL/L FBS的DMEM/F-12培养液的6孔培养板中,于37℃、50 mL/L CO2、100%湿度的培养箱内培养24h后：①取上清,2000r/min,离心20min,于全自动生化仪测定尿素的浓度、乳酸脱氢酶(LDH)及谷丙转氨酶(ALT)浓度。②按照人白蛋白ELISA试剂盒说明,于全自动酶标仪测定上清人白蛋白含量。③贴壁细胞制备成细胞悬液后行病理HE染色,观察细胞形态。(2)取LO2细胞悬液0.5ml,按照ATP试剂盒的说明,裂解细胞后离心,取上清于全自动酶标仪测定细胞内ATP含量。①取上清,按照乳酸测定试剂盒的要求,①于分光光度仪测定乳酸含量。(3)取L02细胞悬液0.5ml,1000r/min,离心2min：沉淀的细胞按照AnnexinV-FITC凋亡试剂盒要求,于流式细胞仪定量测定细胞存活率、凋亡率及坏死率。4、各溶液降温曲线及冰点测定：将1ml蒸馏水、UW液和细胞悬液分别置于2ml冻存管中,将智能温度计电极插入溶液中(避免同管壁接触),然后将冻存管置于-10℃程控低温培养箱内,每一分钟记录一次温度值,绘制成时间-温度曲线[温度取10℃至(-10)℃]。结果1、不同溶液的冰点和零下非结冰温度不同：蒸馏水的冰点是0℃℃；UW液的冰点是-1℃,零下非结冰温度是0℃℃-(-1)℃；L02肝细胞悬液的冰点为-1℃,零下非结冰温度是0℃℃-(-1)℃。2、新鲜细胞存活率为：86.95%±0.58%,随低温保存时间延长,各组细胞存活率呈下降趋势(P<0.001)。24h,各组细胞存活率无差异；48h,-0.8℃组细胞存活率同4℃组相比,开始出现差异；72h,各组细胞存活率显著下降,但-0.8℃组细胞存活率显著高于0℃组及4℃组(P<0.001)。3、新鲜细胞凋亡率为：1.73%±0.20%,随低温保存时间延长,各组细胞凋亡率呈上升趋势(P<0.001)。24h及48h,各组细胞凋亡率无差异；72h,各组细胞凋亡率显著升高,但-0.8℃组细胞凋亡率显著低于0℃组及4℃组(P=0.017)。4、新鲜细胞的ALT释放为：3.83U/L±0.48U/L,LDH释放为：49.52U/L±5.57U/L。随低温保存时间延长,各组细胞ALT、LDH释放呈上升趋势(均P<0.001)。24h各组细胞ALT、LDH释放均无差异；48h,-0.8℃组细胞ALT、LDH释放同4℃组相比开始出现差异；72h,各组细胞ALT、LDH释放显著升高,但-0.8℃组细胞ALT、LDH释放均显著低于0℃组及4℃组(均P<0.001)。5、新鲜细胞的尿素合成为：2.63mmol/L±0.46mmol/L,随低温保存时间延长,各组细胞尿素合成功能呈下降趋势(P<0.001)。24h,各组细胞尿素合成能力无差异；48h,-0.8℃组细胞尿素合成同4℃组相比开始出现差异；72h,各组细胞尿素合成能力显著下降,但-0.8℃组细胞尿素合成能力显著强于0℃组及4℃组(P=0.001)。6、新鲜细胞的白蛋白分泌为：11.90mg/L±0.39mg/L,随低温保存时间延长,各组细胞白蛋白分泌功能呈下降趋势(P<0.001)。24h,各组细胞白蛋白分泌功能无异常；48h,-0.8℃组细胞白蛋白分泌同4℃组相比,开始出现差异；72h,各组细胞白蛋白分泌显著下降,但-0.8℃组细胞白蛋白分泌功能显著优于0℃组及4℃组(P=0.003)。7、新鲜细胞的乳酸释放：3.48ug/10^6cells±0.81 ug/10^6cells,随低温保存时间延长,各组细胞乳酸释放呈上升趋势(P<0.001)。24h,-0.8℃组细胞乳酸释放同4℃组相比,开始出现差异各；48h及72h,各组细胞乳酸释放显著升高,但-0.8℃组细胞乳酸释放显著低于0℃组及4℃组(均P<0.001)。8、新鲜细胞的细胞内ATP含量为：11.29ug/10^6cells±1.66ug/10^6cells,随低温保存时间延长,各组细胞内ATP含量呈下降趋势(P<0.001)。24h,-0.8℃组细胞内ATP含量同4℃组相比,开始出现差异各；48h及72h,各组细胞内ATP含量显著降低,但-0.8℃组细胞内ATP含量显著高于0℃组及4℃组(均P<0.001)。9、新鲜细胞细胞膜完好,细胞浆细胞核可明显区分,死亡细胞少；低温保存72h,4℃组及0℃组细胞较-0.8℃组死亡比例明显增加,细胞膜周围出现“毛刺”样改变,细胞内可见“空泡样”改变。结论1、零下非结冰保存肝细胞较常规低温可明显的提高复温后细胞存活率,降低低温损伤引起的细胞凋亡,有效的保护肝细胞功能。2、零下非结冰保存肝细胞72h后细胞存活率仍然可达70%左右,可作为BLASS用肝细胞短期低温保存一种有效的方式。3、降低细胞凋亡率是零下非结冰明显提高了肝低温保存后细胞存活率的重要途径。4、采用零下非结冰保存肝细胞,建立一个“血库样”(Ready to use)的肝细胞库,可能会有效的促进BLASS的发展。第二部分零下非结冰保存C3A与L02肝细胞后的生物学特性比较目的比较UW液零下非结冰(-0.8℃)保存后C3A与L-02细胞的生物学特性变化及其差异,探索其对生物人工肝的应用倾向。方法具体方法详见第一部分。结果1、随低温保存时间的延长,C3A细胞与L02细胞存活率呈下降趋势(P<0.001)；新鲜细胞及各低温保存时间点24h,48h及72h,C3A细胞存活率均高于L02细胞且有统计学差异(均P<0.001)。2、随低温保存时间的延长,C3A细胞与L02细胞凋亡率呈上升趋势(P<0.001)；新鲜细胞及各低温保存时间点24h,48h及72h,C3A细胞凋亡率均低于L02细胞且有统计学差异(均P≤0.005)。3、随低温保存时间的延长,C3A细胞与L02细胞ALT释放呈上升趋势(P<0.001)；新鲜细胞及各低温保存时间点24h,48h及72h,C3A细胞ALT释放均低于L02细胞且有统计学差异(均P≤0.011)。4、随低温保存时间的延长,C3A细胞与L02细胞LDH释放呈上升趋势(P<0.001)；新鲜细胞及各低温保存时间点24h,48h及72h,C3A细胞LDH释放均低于L02细胞且有统计学差异(均P≤0.001)。5、随低温保存时间的延长,C3A细胞与L02细胞尿素合成呈下降趋势(P<0.001)；新鲜细胞及各低温保存时间点24h,48h及72h,C3A细胞尿素合成均低于L02细胞且有统计学差异(均P<O.002)。6、随低温保存时间的延长,C3A细胞与L02细胞白蛋白分泌呈下降趋势(P<0.001)；新鲜细胞及各低温保存时间点24h,48h及72h,C3A细胞白蛋白分泌均高于L02细胞且有统计学差异(均P<0.001)。结论1、低温保存后C3A细胞的存活率、凋亡率、ALT及LDH释放、白蛋白分泌均优于L02细胞。2、低温保存后L02细胞的尿素合成功能优于C3A细胞。3、以L02细胞为材料的BLASS可能更适用于肝功能衰竭合并肝性脑病。4、以C3A细胞为材料的BLASS可能更适用于肝功能衰竭合并低白蛋白血症。第三部分UW液、Celsior液和HTK液零下非结冰保存肝细胞的效果比较目的体外培养永生化L02细胞,制备成细胞悬液,分别采用UW液、Celsior液和HTK液零下非结冰(-0.8℃)保存72h,以比较其保存效果有无差别并探讨其中可能的机制。方法1、细胞培养：从液氮中取出冻存的L02细胞,迅速投入37℃水浴箱中,待其完全溶解后转入超净台内进行操作。①严格按照无菌操作方法进行,接种到50mL培养瓶。所用基础培养基为DMEM/F-12,同时添加EGF20ng/ml,胰岛素10mg/L,青霉素10kU/L,链霉素10g/L,100mL/L的胎牛血清(FBS)。②将培养瓶置于37℃,50mL/LCO2,100%湿度的培养箱内培养。③倒置显微镜观察80%以上细胞贴壁后换液1次,以后每24h换液1次,直至内壁长满。2、细胞低温保存、分组及复温方式：①移除培养基,PBS液洗涤细胞3次后分别置换为UW液、Celsior液及HTK液5ml,-0.8℃低温保存72h,即实验分为3组：UW液组、Celsior液组及HTK液组,每组6个标本。②低温保存72h后,各组样本均分别移除UW液、Celsior液及HTK液,PBS洗涤细胞3次后置换为5m1的培养液,于37℃,50mL/L CO2,100%湿度的培养箱内培养30min。3、细胞悬液的制备：①取内壁长满的一瓶细胞,吸除培养液,加0.25%胰酶1mL,于室温消化1-3mmin,同时观察细胞形态,一旦发现胞质回缩细胞间隙增大,即刻吸除胰酶,终止消化。②加2mL含10%FBS的DMEM/F-12培养液,用吸管反复吹打内壁,使细胞完全脱离瓶壁成细胞悬液。③取一滴至血细胞计数板,计算细胞细胞密度,最终将细胞浓度调至1×109个/L。4、低温保存复温后各指标测定概括：(1)取L02细胞悬液1ml,加入到1ml含4mmol/L氯化铵及100 mL/L FBS的DMEM/F-12培养液的6孔培养板中,于37℃、50mL/L CO2、100%湿度的培养箱内培养24h后：①取上清,2000r/min,离心20min,于全自动生化仪测定尿素的浓度(氯化铵转化试验)、乳酸脱氢酶(LDH)及谷丙转氨酶(ALT)浓度。②按照人白蛋白ELISA试剂盒说明,于全自动酶标仪测定上清人白蛋白含量。(2)取L02细胞悬液1ml,按照Live/Dead试剂盒要求,于流式细胞仪定量测定细胞存活率、死亡率。结果1、新鲜细胞的存活率是89.33%±2.64%,死亡率是10.08%±2.56%。低温保存72h后,各组细胞存活率较新鲜细胞降低,但UW液组细胞存活率显著高于Celsior液组和HTK液组(P<0.001)；细胞死亡率较新鲜细胞增加,但UW液组细胞死亡率显著低于Celsior液组和HTK液组(P<0.001),2、新鲜细胞释放的ALT是3.93U/L±1.04U/L,LDH是44.00 U/L±5.72U/L。低温保存72h后,细胞ALT释放及LDH释放较新鲜细胞增加,但UW液组ALT及LDH释放均显著低于HTK液组(均P≤0.010)；ALT释放UW液组同Celsior液组无差异(P=0.070),而LDH则有差异(P=0.004)。3、新鲜细胞尿素合成是2.60 mmol/L±0.56mmol/L,白蛋白分泌是12.21mg/L±1.68mg/L。低温保存72h后,细胞尿素合成功能下降,但UW液组尿素合成功能优于HTK液组(P=0.002),同Celsior液组无差别(P=0.358)；细胞白蛋白分泌功能下降,但UW液组白蛋白分泌优于Celsior液组与HTK液组(P0.015),Celsior液组与HTK液组无差别(P=0.618)。结论1、零下非结冰UW液保存肝细胞存活率明显优于Celsior液和HTK液,HTK液细胞存活率最低。2、UW液与Celsior液维持肝细胞的尿素合成功能无差异,但优于HTK液。3、Celsior液和HTK液维持肝细胞白蛋白分泌功能无差异,但不及UW液。4、UW液零下非结冰保存肝细胞不宜超过72h,某些情况下可用Celsior液替代UW液第四部分零下非结冰保存时肝细胞凋亡机制的研究目的凋亡相关基因Bcl-2/Bax比值是衡量细胞凋亡指数的一个重要指标。目前有关SZNFT保存肝细胞时Bcl-2/Bax基因及蛋白表达仍然不明确。因此本文分别采用SZNFT(-0.8℃)、4℃及0℃保存L02细胞,以明确Bcl-2/Bax基因和蛋白表达同低温保存引起细胞凋亡的关系,探索低温保存引起细胞凋亡的可能机制。方法1、具体实验方法详见第三部分。2、低温保存复温后各指标测定概括：(1)取LO2细胞悬液1ml,①取上清,2000r/min,离心20min,于全自动生化仪测定乳酸脱氢酶(LDH)及谷丙转氨酶(ALT)浓度,沉淀细胞按照AnnexinV-FITC凋亡试剂盒测定细胞存活率、凋亡率。(2)取细胞悬液1ml,1000r/min,离心2min,沉淀细胞按TotalRNA提取试剂盒(NPK201, Toyobo)要求及一步法Realtime-PCR试剂盒(QRT201, Toyobo)要求于定量PCR仪测定Bcl-2/Bax目的基因mRNA及P-actin基因mRNA的定量表达。(3)取细胞悬液lml,1000r/min,离心2min,沉淀细胞按蛋白抽提试剂盒提取蛋白,Western Blot测定Bcl-2/Bax蛋白及β-actin蛋白的定量表达。结果1、新鲜细胞的存活率是87.35%±1.97%,凋亡率是1.73%±0.26%。低温保存72h后,各组细胞存活率较新鲜细胞降低,但-0.8℃组细胞存活率显著高于0℃组和4℃组(P<0.001)；细胞凋亡率较新鲜细胞增加,但UW液组细胞凋亡率显著低于0-℃组和4℃组(P=0.019)。2、新鲜细胞释放的ALT是3.78U/L±0.48U/L,LDH是39.48 U/L±5.72U/L。低温保存72h后,细胞ALT释放及LDH释放较新鲜细胞增加,但-0.8℃组ALT及LDH释放均显著低于4℃组(均P≤0.001)；ALT释放0-C组同-0.8℃组无差异P=0.088),而LDH则有差异(P=0.002)。3、新鲜细胞及各组细胞所提Total RNA采用分光光度仪测定,A260/A280的光密度OD值均在1.8～2.0之间,采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳可见清晰的三条RNA条带：28S、18S、5S,说明RNA质量良好可以进行Realtime-PCR扩增。4、以β-actin为内参,分别计算新鲜细胞和各组细胞的Bcl-2-mRNA和Bax-mRNA的定量表达。新鲜细胞Bcl-2-mRNA和Bax-mRNA呈基础表达。低温保存72h后各组Bcl-2-mRNA表达下降,但-0.8℃组显著高于0℃组及4℃组(P<0.001),0℃组及4℃组Bcl-2-mRNA表达无差异(P=0.387)；Bax-mRNA表达则相反,-0.8℃组显著低于0℃组及4℃组(P<0.001),且0℃组及4℃组无差异P=0.432)；-0.8℃组Bcl-2/Bax比值显著高于0℃组及4℃组(P<0.001)。5、以β-actin为内参,Western blot测定新鲜细胞和各组细胞的Bcl-2蛋白和Bax蛋白的定量表达。新鲜细胞Bcl-2和Bax蛋白呈基础表达。低温保存72h后,-0.8℃组Bcl-2蛋白显著高于0℃组及4℃组(P<0.001),0℃组及4℃组Bcl-2蛋白表达无差异(P=0.300)；Bax蛋白则相反,-0.8℃组Bax蛋白显著低0℃组及4℃组(P=0.006)。-0.8℃组Bcl-2/Bax比值显著高于0℃组及4℃组(P<0.001)。结论1、UW液零下非结冰保存肝细胞较常规低温(0℃及4℃C)明显降低了细胞凋亡率。2、线粒体途径相关的细胞凋亡可能在肝细胞低温保存损伤中发挥了重要的作用。3、零下非结冰明显降低了低温保存引起的细胞凋亡,其机制可能同Bcl-2/Bax比值改变有关。