帕金森病(parkinsons disease，PD)是发生在中老年常见的神经系统退行性疾病，主要病变在黑质纹状体通路，显微镜下可见黑质致密部(substantia nigra parscompacta，SNpc)大量多巴胺能神经元凋亡，残留的神经元细胞胞浆中圆形嗜酸性Lewy包涵小体形成。PD发病多种因素参于其中，遗传因素可使患病易感性增加，而在环境因素及衰老的相互作用下，导致黑质多巴胺能神经元凋亡加速，多巴胺(dopamine，DA)合成减少，出现一系列PD的症状。近年来，大量流行病学及病例.对照研究揭示，许多环境毒素诸如杀虫剂、除草剂等可引起大脑黑质多巴胺能神经元凋亡，长期接触可引发PD；而做为脑内正常神经递质之一的DA，一旦其在胞质内或细胞外间隙的游离形式升高同样可导致细胞损伤。在PD的治疗方面，针对患者体内紊乱的神经内分泌环境，以逆转多巴胺能与胆碱能神经递质失衡为根本目的的医疗手段前景可观。　　 分泌粒蛋白Ⅲ(secretograninⅢ，SCG3/SgⅢ)是分泌粒家族(granin family)中一个较新的成员，其生物学特性、病理生理学及临床意义日益受到关注。SCG3广泛分布于内分泌腺体、神经内分泌组织与神经系统。大量研究已经表明，在反面高尔基网状结构(trans-Golgi network，TGN)，SCG3对具有生物活性的肽类与胺类物质进行组装、靶向输送以及后续的分泌颗粒形成发挥着重要作用。SCG3在代谢性疾病(病理性肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化)，神经内分泌肿瘤(小细胞型肺癌、前列腺癌)以及由雌激素代谢失调引起的内分泌紊乱等方面的研究已有报道，其病理生理学意义主要体现在对体内胺类及肽类物质的储存、转运并参与调节释放过程。鉴于SCG3广泛且特异的分布特征及特有的生物学功能，该蛋白已经成为研究哺乳动物内分泌腺体及中枢神经系统分泌颗粒分布特征最具价值的生物学标记，并对神经与精神疾病、神经内分泌肿瘤及其他代谢性疾病的诊断、疗效及预后评估具有重要的临床指导意义。　　 Caspase家族凋亡效应组成员caspase-3、-6、-7具有相似的功能和相近的底物特异性，激活后能极为有效的水解维持细胞基本结构和重要功能的蛋白质，从而诱导细胞凋亡发生。对caspase酶切底物的研究，将有助于阐明caspase依赖途径致细胞凋亡的机制。研究caspase介导的凋亡细胞中SCG3基因与蛋白表达量变化及其相关的分子机制，证实SCG3在细胞凋亡发生发展过程中所充当的角色，有助于对其生物学功能深入研究并探究其参与PD发病的机制。以中国北方汉族健康人群与PD患者血样为试验对象进行病例-对照研究，对SCG3基因编码区错义突变及框移突变进行等位基因多态性调查，并研究单核苷酸位点与PD的相关性，将为整体研究SCG3基因及其与神经系统疾病的相关性提供有价值的资料。　　 在多巴胺能神经元中，关于神经递质转运相关蛋白功能失调与PD关系的研究尚不多见。因此，深入研究神经毒素对多巴胺能神经元以及神经递质转运相关蛋白的作用，对于明确PD发病机制具有重要的现实意义。本实验选择具有神经内分泌及神经元特性的SH-SY5Y细胞作为研究对象，以常用农业除草剂百草枯(paraquat，PQ)做为外源性毒素，脑内正常神经递质DA做为内源性毒素，检测SH-SY5Y细胞在两种不同神经毒素单独或联合诱导后细胞内pro-Casp-3表达变化及可能的作用底物，深入研究神经毒素致多巴胺能细胞凋亡发生机制。研究在细胞凋亡模型下SCG3基因及蛋白水平表达量变化及其相关的分子机制，证实SCG3在细胞凋亡发生发展过程中所充当的角色，进而探究其参与PD发病的机制，以期为PD的预防及有效治疗寻找新的靶点。　　 材料与方法：　　 1、MTT法检测SH-SY5Y细胞经PQ和/或DA诱导后细胞增殖与存活率变化，倒置相差显微镜下观察神经毒素诱导后细胞形态学改变；　　 2、蛋白免疫印迹检测PQ和/或DA诱导的SH-SY5Y细胞内pro-Casp-3及PARP的表达变化，分析神经毒素是否可通过caspase-3依赖的方式诱导细胞发生凋亡；　　 3、半定量PCR与荧光实时定量PCR分析PQ诱导前后SH-SY5Y细胞内SCG3mRNA表达变化；　　 4、蛋白免疫印迹分析PQ诱导前后SH-SY5Y细胞内及分泌出胞的SCG3蛋白量变化，以及z-VAD-fmk对PQ诱导的凋亡细胞中SCG3蛋白表达影响；　　 5、细胞免疫荧光检测SH-SY5Y细胞内SCG3蛋白与CgA蛋白的相互作用，并分析PQ诱导前后SCG3蛋白亚细胞分布的改变；　　 6、采用人重组caspase-3、-6、-7酶切外源性SCG3蛋白(HEK293细胞中过表达的SCG3基因完整编码区重组质粒)及内源性SCG3蛋白(未处理的SH-SY5Y细胞)，体外实验验证SCG3蛋白是否可被caspase酶切；　　 7、重叠延伸PCR构建SCG3基因定点突变体，采用人重组caspase-3、-6、-7酶切外源性SCG3蛋白(HEK293细胞中突变的SCG3基因重组质粒)，体外实验鉴定SCG3蛋白序列上caspase酶切位点；　　 8、收集中国北方汉族PD患者与健康人血液样本，酚-氯仿法提取基因组DNA，PCR-RFLP法对SCG3编码区可导致框移突变或错义突变的单核苷酸位点进行等位基因多态性调查，并验证与PD的相关性；　　 9、转染包含错义突变的SCG3重组质粒，蛋白免疫印迹检测错义突变对SCG3蛋白表达量的影响。　　 结果：　　 1、PQ和/或DA诱导的SH-SY5Y细胞，细胞增殖被抑制且存活率下降，其中以毒素联合诱导后细胞最为明显，提示二者的神经毒性具有协同作用。毒素诱导后存活细胞形态变化显著，可见细胞胞体皱缩，神经突缩短甚至消失。　　 2、PQ和/或DA诱导的SH-SY5Y细胞内pro-Casp-3含量明显降低且伴随部分PARP酶切，表明二者单独或联合诱导细胞后均以caspase-3依赖方式致细胞凋亡。caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk可有效阻滞PQ诱导的细胞凋亡，并使细胞内pro-Casp-3含量明显恢复。　　 3、PQ诱导的SH-SY5Y凋亡细胞内，SCG3 mRNA及蛋白表达水平较对照组明显降低，其中以蛋白水平变化最为显著，而z-VAD-fmk可有效阻滞凋亡细胞中SCG3蛋白表达量降低。　　 4、DA诱导的SH-SY5Y凋亡细胞内，SCG3蛋白表达量较对照组明显下降，表现出与PQ诱导后SH-SY5Y细胞相似的结果。　　 5、在SH-SY5Y细胞胞浆中，SCG3蛋白呈颗粒状均匀分布于整个胞浆及神经突中，并与其家族成员CgA相互结合形成复合物。　　 6、对SH-SY5Y细胞内SCG3蛋白的分布及表达量进行定性与定量研究发现，SCG3蛋白在SH-SY5Y细胞胞浆中表达丰富，经过PQ诱导后，SCG3蛋白颗粒似乎仅分布在核周，且蛋白表达水平较对照组显著下降。　　 7、在生理状态下及神经毒素诱导后，SH-SY5Y细胞可将胞浆中部分SCG3蛋白分泌致细胞外间隙。　　 8、在体外实验研究中，转染SCG3基因完整编码区重组质粒的HEK293细胞以及未处理的SH-SY5Y细胞，均可检测到分子量约为68 kDa的SCG3完整蛋白；将上述细胞蛋白经人重组caspase-3、-7作用后，分子量为68 kDa的SCG3蛋白经酶切后可观测到一分子量约为40 kDa的蛋白片段。然而，caspase-6不能酶切SCG3蛋白。　　 9、在体外实验研究中，转染引入定点突变的SCG3基因重组质粒的HEK293细胞，可检测到分子量约为68 kDa的SCG3完整蛋白，而人重组caspase-3、-6、-7不能将该蛋白酶切。　　 10、在体内实验研究中，PQ诱导的SH-SY5Y细胞内，仅可见分子量为68 kDa的SCG3蛋白降低，但未观察到明确的降解片段。　　 11、SH-SY5Y细胞SCG3基因完整编码区测序及病例-对照研究鉴定出2个新的点突变，分别为254 A/-与1033 A/G。对疾病组与对照组的基因型数据分析显示，254A/-与1033A/G在疾病组中各检出2例杂合子，在对照组中各检出1例杂合子；而已报道的rs35883815位点在本次调查的300例样本中未检出。三个单核苷酸位点与PD均没有明显的相关性。　　 12、含有1033G点突变的SCG3重组质粒较含有1033A位点的SCG3重组质粒蛋白表达量下降。　　 结论：　　 1、PQ与DA均可抑制SH-SY5Y细胞增殖，且二者的神经毒性具有协同作用，均以caspase-3依赖方式致细胞凋亡。　　 2、PQ或DA诱导的SH-SY5Y凋亡细胞内，SCG3基因及蛋白表达水平均显著下降。　　 3、在多巴胺能细胞SH-SY5Y胞浆中SCG3蛋白与CgA蛋白形成复合物，且该细胞可将部分SCG3蛋白分泌至细胞外，而经PQ诱导的凋亡细胞中SCG3蛋白的亚细胞分布改变明显，即多为核周分布。　　 4、SCG3蛋白存在着caspase-3、-7的酶切识别序列，在第136位与第137位氨基酸之间为酶切位点，但SCG3蛋白不能被caspase-6酶切。　　 5、SCG3基因编码区254A/-、1033A/G、rs35883815三个单核苷酸位点在中国北方汉族健康与PD人群中均表现出较低的杂合度，且与PD没有明显的相关性。　　 6、1033A/G点突变可导致SCG3蛋白表达量下降。