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化学农药的过度使用造成了严重的生态环境问题,因此环境友好的害虫生物防治,如真菌杀虫剂的研制与应用已成为国内外研究热点。但真菌杀虫剂的应用一定程度上受到了其杀虫速率缓慢、环境应用不稳定等问题的制约。因此,进行杀虫真菌分子致病机理的研究,揭示不同毒力基因及其作用机理是非常必要的。球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是子囊菌门的代表性杀虫真菌种类,具有典型的真菌致病侵染过程,是研究虫生真菌致病机理和真菌—昆虫互作研究的理想系统。 几丁质是真菌细胞壁的主要组分,在病原真菌侵染宿主的过程中,是一种重要的病原相关分子,容易引起寄主的免疫识别,病原菌因而进化出几丁质结合蛋白。近年来,以植物病原菌为对象的研究发现了不同种类的几丁质结合蛋白,其中一大部分蛋白含有LysM结构域。这些LysM蛋白多广泛参与植物病原真菌防御宿主免疫的过程,是一种效应蛋白(Effector)。但这些效应蛋白在虫生真菌中是否存在及作用机制尚不清楚。 本论文研究以球孢白僵菌为研究对象,利用基因组信息,生物信息学方法分析获得含有LysM结构域的蛋白种类,根据不同蛋白基因在不同条件下的表达特征,确定潜在的LysM效应蛋白基因,通过基因敲除和昆虫生物测定,分析LysM结构域蛋白在白僵菌致病过程中的作用与功能;同时通过蛋白原核表达,验证了不同LysM蛋白的几丁质结合活性。具体研究结果如下: 在白僵菌基因组中我们分析获得12个含有LysM结构域蛋白,其中有6个蛋白基因在白僵菌感染昆虫的过程中表现出较高的表达水平。这6个基因缺失突变株的生长速度和细胞形态和野生型并无显著差异,但使用大蜡螟(Galleriamellonella)幼虫进行生物测定的结果表明,其中Blys2(BBA_03138)和Blys5(BBA_08602)突变体的杀虫毒力显著下降,Blys2缺失降低了白僵菌孢子突破昆虫血细胞包裹及在血腔中的增殖能力。在Blys2敲除菌株中异源回补稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的效应蛋白Slp1,可以回补上述突变体表型;GFP标记、Western Blotting及多糖结合实验结果表明,Blys2蛋白与Slp1功能类似,可分泌到胞外环境而特异性结合细胞壁中的几丁质成分。同野生型相比,△Blys2的感染诱导大蜡螟抗真菌肽gallerimycin基因的表达水平显著上升,说明Blys2具有抑制宿主昆虫免疫的作用。 总之,以上研究结果表明,Blys2是球孢白僵菌重要的毒力因子,作为效应蛋白,通过结合细胞壁几丁质而避免诱导昆虫宿主的免疫反应,提高侵染效率。