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褪黑素是一种主要由松果体合成的激素。作为一种强效的抗氧化物,褪黑素能清除体内自由基从而保护机体免受氧化损伤。同时,褪黑素除通过调控下丘脑垂体影响哺乳动物生殖生理外,还直接参与对卵巢功能的调节。目前已在哺乳动物的生殖系统中检测到褪黑素两种膜受体MT1和MT2的表达,并且发现卵巢自身能够合成褪黑素,这表明褪黑素参与对卵巢功能的调节。然而卵巢中褪黑素的合成及膜受体表达是否受其他因素调节还尚不清楚。本研究以绵羊卵巢为研究对象,首先通过qPCR、western blotting以及免疫组织化学等实验技术,分析褪黑素合成酶（AANAT和HIOMT）及其膜受体（MT1和MT2）在绵羊不同发情时期的周期黄体以及不同大小卵泡内卵丘复合体中的表达及分布特征。其次,通过体外培养绵羊黄体细胞及卵丘复合体,分析孕酮（P4）、雌二醇（E2）及其受体拮抗剂对黄体细胞及卵丘复合体中褪黑素相关蛋白表达的影响。最后通过Lable-free非定量蛋白质组学方法分析褪黑素对绵羊体外培养颗粒细胞中蛋白质组水平的影响,进一步阐明褪黑素调控绵羊卵巢功能影响的分子机制。本研究取得的主要结果如下:1.本实验通过qPCR、western blotting、免疫组织化学法和ELISA技术,分析了绵羊不同发情时期的周期黄体中MT1、MT2、AANAT和HIOMT的定量和定位表达,以及黄体中褪黑素水平的变化。结果显示,MT1、MT2、AANAT和HIOMT在中期黄体（排卵后6-12天）中表达最高,而在早期（排卵后1-5天）和晚期黄体（排卵后13-18天）中表达较低。同时,中期黄体中褪黑素水平显著高于早期和晚期黄体。上述结果不仅表明绵羊黄体能够合成褪黑素,而且表明黄体也是褪黑素的作用靶点之一,提示褪黑素在黄体的发育和维持中发挥重要作用。2.体外培养处于发情周期中期的绵羊黄体细胞,并用不同浓度的P4及孕酮受体（PGR）拮抗剂RU486处理黄体细胞。通过qPCR和western blotting检测发现,10-9和10-8M P4能够促进黄体细胞中MT1和MT2的表达。但与10-8M P4处理组相比,10-7M P4则抑制黄体细胞中MT1和MT2的表达。同时RU486也显著抑制黄体细胞中MT1和MT2的表达,并且较高水平的P4(10-7M)显著抑制了黄体细胞中PGR的表达。表明P4通过其核受体途径促进了黄体细胞中MT1和MT2的表达。但较高水平的P4通过抑制PGR的表达,从而阻断了P4对MT1和MT2表达的促进作用。3.本实验通过qPCR、western blotting、免疫组织化学和ELISA技术,分析了绵羊不同大小卵泡内的卵丘复合体中MT1、MT2、AANAT和HIOMT的表达以及不同大小卵泡液中褪黑素水平的变化。结果显示,MT1、MT2、AANAT和HIOMT在小卵泡内卵丘复合体中的表达水平显著高于大卵泡内的卵丘复合体。然而,大卵泡液中褪黑素水平显著高于小卵泡液。这些结果不仅表明褪黑素通过自分泌或旁分泌途径参与卵泡和卵母细胞的发育调控,而且提示绵羊卵丘复合体自身能够合成并分泌褪黑素,并且大卵泡内卵丘复合体自身分泌的褪黑素可能不是卵泡液中褪黑素的主要来源。4.体外培养绵羊卵丘复合体并用E2及雌激素受体（ER）抑制剂ICI182780进行处理。通过qPCR和western blotting检测发现,E2下调卵丘复合体中MT1、MT2、AANAT和HIOMT的表达以及褪黑素的分泌。而ICI182780则缓解了E2对卵丘复合体中褪黑素相关蛋白表达的抑制作用,并一定程度的恢复了卵丘复合体中褪黑素水平。上述结果表明,E2通过雌激素受体途径参与调节卵丘复合体中褪黑素的合成及其膜受体的表达。5.通过Lable-free非标记定量蛋白质组学技术分析鉴定10-9M褪黑素处理后,绵羊卵巢颗粒细胞中的差异蛋白。经过生物学分析共发现64个差异蛋白,其中褪黑素处理后的颗粒细胞中18个蛋白表达上调,6个表达下调。另外,共有34个蛋白在褪黑素处理组中不表达,而在对照组中表达;而6个蛋白则在褪黑素处理组中表达而在对照组中不表达。通过western blotting验证5个差异蛋白SOD1、EGFR、CAV1、FADD及COLIA1的表达。结果显示所选蛋白的表达变化趋势与Lable-free鉴定结果基本一致,表明Lable-free所得的结果可靠。结合生物信息学分析表明褪黑素主要通过抗氧化、抗凋亡与炎症反应等多种途径参与了对绵羊卵巢颗粒细胞功能的调节。综上所述,绵羊不同时期周期黄体以及不同大小卵泡内卵丘复合体中均有褪黑素相关蛋白的表达和褪黑素的合成,并且褪黑素相关蛋白的表达和褪黑素的合成受E2及P4的调控;此外,褪黑素可通过抗氧化、抗凋亡与炎症反应等多种途径参与对绵羊卵巢颗粒细胞功能的调节。该结果初步为进一步研究绵羊生殖机理的调控机制提供了基础资料。