第一部分【研究背景】慢性脑缺血(Chronic cerebral hypoperfusion,CCH)为临床常见病、多发病,致死率、致残率高,可导致认知功能障碍,严重危害人类健康。迄今为止,CCH导致认知功能障碍的发病机理不完全清楚,尚无特效药物和治疗手段,因此,CCH导致认知功能障碍的发病机制与防治是神经科学关注的焦点。CCH发病机制复杂,其主要的病理过程包括缺血导致细胞能量缺失、细胞坏死和凋亡、脑白质损伤、血脑屏障破坏、脂质代谢和神经血管单元功能紊乱,神经发生受损等。神经发生即新的神经元产生的过程,包括神经干细胞的增殖、迁移、分化,最终新生成的神经元并整合到局部神经环路。临床上中风患者数周至数月后症状有所改善,部分得益于脑部这种内在的修复机制,因此促进脑缺血损伤后的神经发生对其治疗有重要意义。当脑组织受到损伤或炎症等刺激时,局部微环境发生改变,神经干细胞即被活化,进而增殖、迁移、分化产生新的神经元,发挥代偿和修复功能。众多因素影响CCH时的神经发生,其中核受体超家族重要成员——肝X受体(Liver X receptors,LXRs),在神经发生中的地位日益受到关注。LXRs包括两种亚型——LXRα和LXRβ。LXRα主要表达在肝脏、肾脏、小肠、脾脏、脂肪组织等参与外周脂质代谢的器官;LXRβ表达十分广泛,其中肝脏和大脑的表达水平最高。中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中,LXRs是最主要的维持胆固醇平衡和抗炎的因子。胆固醇代谢失调参与众多神经退行性疾病的发病,尤其在CCH发生发展的过程扮演重要角色,通过调节或纠正脂质代谢紊乱,有可能用于CCH的临床治疗。研究表明,LXRα和LXRβ作为抗炎转录因子,参与先天免疫和适应性免疫应答,亦可作为细胞凋亡和吞噬的生理调节剂。来自细胞凋亡时细胞膜破裂的胆固醇衍生物,作为LXRs激动剂发挥抗凋亡的作用。已有研究证实,LXRs受体激动剂GW3965可剂量依赖性地促进神经干细胞增殖,提示LXRs可能参与了神经发生,推测可能在改善CCH导致的认知障碍中也发挥着重要的作用。因此,LXRs可能作为CCH潜在的治疗新靶点具有非常重要的意义。【研究目的】以脑内LXRs为研究对象,探讨LXRs参与CCH的发病机制、激活LXRs改善CCH引起的学习记忆障碍的分子机制。拟通过阐明LXRs激动剂GW3965提高神经元的存活、促进神经干细胞的增殖,从而改善CCH引起的学习记忆障碍的研究机制。该研究为治疗CCH提供新靶点,为临床研究提供思路和理论依据。【研究方法】1.免疫荧光法观察LXRα、LXRβ在海马是否有特异性表达、分布;进一步通过LXRβ与神经元/胶质细胞标志物(Neu N/GFAP)双标共染确定LXRs分布的细胞特异性,将LXRβ与抑制性/兴奋性神经元标志物(GABA/VGLUT2)双标染色确定表达的神经元类型。2.微弹簧圈法造成双侧颈动脉狭窄(Bilateral carotid stenosis,BCAS)建立CCH小鼠模型;Morris水迷宫行为学评价CCH是否能够导致小鼠学习记忆功能障碍,进而给予GW3965治疗15 d是否可改善CCH导致的小鼠学习记忆障碍。3.给予或不给予GW3965治疗,观察HE染色小鼠的PFC(Prefrontal cortex)、CA1区域神经元形态、存活率变化。4.采用Western blot的方法,检测CCH模型小鼠PFC、CA1中LXRs不同亚型表达水平的变化。5.采用Western blot的方法,检测该模型小鼠脑内谷氨酸离子型受体与凋亡信号通路上相关蛋白表达的变化;并观察给予GW3965治疗后是否逆转这些蛋白的表达。6.体外培养神经元,建立氧糖剥夺模型(OGD)模拟CCH模型,利用MTT检测不同时间梯度Co Cl2对细胞存活率的影响,以及给予不同浓度梯度GW3965细胞存活率的变化。7.Brd U掺入(100 mg/kg i.p,连续3 d)、染色法观察CCH建模30 d小鼠海马齿状回(DG)区神经干细胞增殖的变化,给予GW3965治疗CCH小鼠,DG区神经干细胞增殖的变化。8.体外培养神经干细胞,首先采用免疫荧光双标技术观察LXRα、LXRβ与神经干细胞标志物Nestin是否共表达;并观察给予不同浓度梯度GW3965处理后是否会浓度依赖性的促进神经干细胞增殖。9.设计并包装生产LXRα、LXRβ慢病毒载体(sh LXRα、sh LXRβ);通过免疫荧光和Western blot验证sh LXRα、sh LXRβ体外感染神经干细胞的效率及下调LXRα、LXRβ表达水平的效果;10.sh LXRα、sh LXRβ、sh LXRα+sh LXRβ分别感染NSCs 72 h后,给予GW3965处理3 d,经Brd U(100μg/ml,4 h)掺入后免疫荧光染色法分析细胞增殖的变化,明确GW3965促NSCs增殖效应的LXRs受体亚型。11.为探究PI3K/Akt信号通路在GW3965促NSCs增殖中的作用,首先Western blot法观察GW3965对NSCs中Akt磷酸化的影响(时间依赖性和浓度依赖性);进而预先给予PI3K特异性抑制剂LY294002(20μM,2 h)处理,观察GW3965对p-Akt表达水平的影响;最后,Brd U掺入法分析LY294002对GW3965促NSCs增殖效应的影响,明确GW3965是否通过PI3K/Akt信号通路促NSCs增殖效应。【研究结果】1.免疫荧光染色结果显示,LXRβ海马区的表达多,LXRα在海马区表达较少。2.Morris水迷宫结果显示,与假手术组相比,CCH导致小鼠学习记忆障碍,表现为小鼠搜索平台时间(潜伏期)延长,游泳距离增加,穿越平台次数减少;与模型组相比,GW3965治疗后,显著改善CCH导致的小鼠学习记忆障碍。3.HE染色结果证实,与假手术组相比,模型小鼠的PFC、CA1区域神经元的结构不清晰,出现细胞核固缩和大量细胞凋亡;与模型组相比,给予GW3965治疗后神经元的形态结构与正常相似,细胞凋亡的比例下降。4.Western blot结果显示,与假手术组相比,CCH模型小鼠PFC、CA1中LXRβ表达水平显著下调,LXRα表达水平的变化不明显。5.Western blot结果表明,与假手术组相比,CCH模型小鼠海马中谷氨酸离子型受体——NMDAR的亚基Glu N2B表达水平增加而Glu N2A基本不变,AMPAR的Glu R1亚基丝氨酸831、845位点磷酸化减少,同时,凋亡信号通路中Bax、PARP表达增加而Bcl-2表达下降;给予CCH小鼠GW3965治疗后,可以逆转上述这些蛋白表达的变化。6.以Co Cl2(200μM)孵育培养的神经元模拟氧糖剥夺病理条件,MTT检测结果发现,Co Cl2干预后神经元存活呈时间依赖性降低,大约50%细胞于缺氧12 h时死亡;给GW3965处理后发现,GW3965浓度依赖性提高细胞的存活。7.采用Brd U掺入免疫荧光染色法分析NSCs的增殖,结果显示,与假手术组相比,CCH小鼠DG区Brd U阳性的NSCs数目显著减少,提示CCH中NSCs增殖受损;给予GW3965治疗后,与CCH组相比,GW3965恢复CCH小鼠DG区NSCs的增殖,提示GW3965具有促NSCs增殖的作用。8.体外培养NSCs,免疫荧光双标法观察NSCs中LXRα、LXRβ的表达,发现LXRα、LXRβ与NSCs标志物Nestin共存;给予不同浓度LXRs的激动剂GW3965处理,发现GW3965浓度依赖性的促进神经干细胞增殖。9.包装生产LXRα/LXRβ的慢病毒载体;免疫荧光和Western blot显示,sh LXRα、sh LXRβ高效感染神经干细胞,并显著下调LXRα、LXRβ表达水平。10.分别以sh LXRα、sh LXRβ感染NSCs下调蛋白表达水平,采用Brd U掺入荧光染色法发现,如前给予GW3965处理3 d后,sh LXRβ转染后GW3965促NSCs增殖效应被取消,而sh LXRα转染后不影响GW3965促NSCs增殖作用,提示GW3965促NSCs增殖效应通过激活LXRβ而非LXRα实现。11.Western blot结果显示,GW3965时间、浓度依赖性增加NSCs中Akt磷酸化水平,其中GW3965刺激NSCs 15 min(10μM)或10μM(15 min)时,Akt的磷酸化即达高峰;给予NSCs预处理LY294002(20μM)2 h,GW3965磷酸化Akt的效应则消失,相应的GW3965促NSCs增殖作用亦被取消,提示GW3965促进NSCs增殖的效应与PI3K/Akt信号通路活化相关。【研究结论】本研究证实,通过微弹簧造成双侧颈动脉狭窄成功建立小鼠CCH模型,CCH导致小鼠学习记忆障碍;给予CCH小鼠GW3965治疗,可改善CCH小鼠的学习记忆障碍。深入的机制研究发现,GW3965通过抑制凋亡信号通路提高神经元的存活;同时,GW3965通过激活LXRβ,进而活化PI3K/Akt信号通路促进NSCs增殖参与CCH神经发生。研究结果提示,激活LXRs提高CCH发生发展过程中神经元的存活、促进NSCs增殖,从而改善CCH导致的学习记忆障碍。因此,LXRs可能作为CCH潜在的治疗新靶点。第二部分【研究背景】慢性炎性痛(Chronic inflammatory pain)是一种与组织损伤或潜在的损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验,能够诱发不良情绪,使患者的病情加重。研究证实,前扣带皮层(Anterior cingulate cortex,ACC)是大脑的疼痛处理区之一,是痛觉调节的重要组成部分。已证实,慢性痛潜在的机制包括ACC区神经元过度兴奋以及胶质细胞的激活,其中,胶质细胞的激活导致炎症的级联反应是诱发慢性痛的重要原因。天麻素(Gastrodin,GAS)是从天麻中分离出的主要活性成分之一,具有镇痛、促智、抗炎作用。因此,GAS可能作为慢性炎性痛潜在的治疗药物具有非常重要的意义。【研究目的】GAS对改善CFA诱发慢性炎性痛小鼠行为学的影响,拟通过阐明GAS改善CFA引起的慢性炎性痛及具有抗焦虑效应,抑制炎症信号蛋白的过表达,从而发挥其镇痛作用的研究机制。为临床治疗慢性炎性痛提供思路和理论依据。【研究方法】本实验通过检测机械痛阈值与热痛阈值,观察给予GAS后CFA诱导的慢性炎性痛小鼠的行为学变化。高架十字迷宫(Elevated plus-maze test,EPM)和旷场实验(Open field test,OFT)检测给予GAS后,慢性炎性痛诱导的焦虑样行为的改变。免疫荧光观察小鼠ACC区星形胶质细胞与小胶质细胞的活化情况,Western blot观察ACC区神经可塑性蛋白与炎性相关的蛋白表达变化。【研究结果】GAS能显著缓解CFA诱导的小鼠慢性炎性痛和伴随的焦虑样行为。GAS治疗后,降低CFA小鼠ACC区NMDAR亚基Glu N2A与Glu N2B、AMPAR亚基Glu R1及Ca MKII-α表达的上调,提示与神经可塑性相关的关键分子参与慢性炎性痛及其伴随的焦虑样行为。此外,GAS减少CFA小鼠ACC区星形胶质细胞和小胶质细胞的活化,降低与炎症相关信号蛋白p-JNK和p-P38,IL-6和TNF-α的表达,提示GAS可能通过调控炎症通路的活化发挥其镇痛作用。【研究结论】研究证明,GAS抑制CFA小鼠ACC区星型胶质细胞与小胶质细胞的活化,并通过逆转了与神经可塑性相关的Glu N2A,Glu N2B、Glu R1和Ca MKII-a,及炎症信号相关蛋白磷酸化JNK和P38,IL-6和TNF-α的表达,改善CFA诱发慢性炎性痛小鼠行为。因此,GAS可能作为临床治疗慢性炎性痛的潜在药物。