研究背景超声造影剂(Ultrasound Contrast Agents, UCAs)是一类能够显著增强医学超声检测信号的诊断药物,是一种含有高浓度微气泡的制剂。包裹气体的微泡制剂具有强烈的超声波散射性能,经静脉注射到达体内各器官微循环后,可使超声回波信号显著增强,组织、器官图像质量显著改善,从而大大提高超声诊断效果。UCAs的出现显著提高了超声诊断的敏感性与特异性,进一步拓展了超声诊断领域,使超声诊断由“平扫时代”进入“增强时代”,被誉为超声诊断领域的第三次革命。更值得注意的是,对于某些诊断而言,它们将是帮助超声有效竞争MRI、CT的关键技术之一。新型UCAs的制备与应用研究是近年来超声医学研究的热点与前沿。UCAs的发展经历了从第1代包裹空气的微泡制剂到第2代包裹氟碳类惰性气体的微泡制剂,造影剂在稳定性和有效性方面均取得了突破性的进展。目前,UCAs研制的重要发展方向是成膜材料的改进,目的是使造影剂使用更安全、造影持续时间更长。从UCAs研制的历史看,九十年代初期研制的造影剂多采用人血白蛋白作为成膜材料,九十年代后期开始向脂质材料或多聚体材料方向发展。原因在于,从安全方面考虑,人血白蛋白作为血液制品存在传播血液传播性疾病的可能,安全性不如脂膜造影剂；从造影效果看,脂膜造影剂由大分子脂质构成的脂膜比变性白蛋白形成的膜更稳定、更有弹性,造影效果更好,持续时间更长,更能满足临床的需要。因此,脂质微泡的研发是目前UCAs发展的主流。UCAs市场是一个新兴而蓬勃发展的市场,国外已有的UCAs价格十分昂贵,因此,在国内研发UCAs具有重要价值。欧美国家已经先后开发出新一代的脂质UCAs,如SonoVue、Definity等,目前UCAs市场均被欧美国家所垄断。国内UCAs的研究以我科为先导,先后开发出“东冠注射液”、“全氟显”等以白蛋白为外壳的UCAs,其声学活性在许多方面均优于国外同类产品。由于与人血白蛋白UCAs相比,脂质UCAs存在着明显的优势,所以后续开发上市的造影剂都以脂质UCAs为主。因此,本课题组正致力进行新型脂质微泡UCAs的研究开发工作,以填补国内脂质UCAs市场的空白。目的1对脂质微泡UCAs的处方、制备工艺进行改进、优化,以制备出高浓度、粒径适宜、稳定有效的脂质微泡制剂,为脂质UCAs勺新药研发提供试验依据。2对脂质微泡UCAs的理化性质进行评价,包括其外观形态、浓度、粒径、分布、内含气体全氟丙烷含量测定、耐压稳定性、以及液体制剂贮存稳定性,以初步探索脂质UCAs的质量标准。3进一步探讨脂质微泡UCAs的动物药效学特性,对其在新西兰大白兔肝和肾的显影效果进行评价。方法1工艺参数及处方优化研究1.1工艺优化采用高速剪切法制备脂质微泡UCAs,单因素试验分析脂质微泡的制备工艺参数,包括剪切速度、剪切时全氟丙烷气体通气时间、剪切时间。每个因素分别设不同水平,剪切速度(4档、5档、6档)、剪切时全氟丙烷气体通气时间(15s、30s、45s、60s)、剪切时间(90s、110s、120s、130s、150s),以微泡的浓度、平均粒径为指标,通过方差分析优选出最佳工艺参数。1.2处方优化采用优选的剪切工艺参数,以混合磷脂为成膜材料,全氟丙烷气体为内核材料制备脂质微泡。磷脂总浓度、DPPE-PEG5000的比例、DPPA的比例以及NaCl浓度是影响脂质微泡浓度及粒径的重要因素,因此,以磷脂总浓度(A)、DPPE-PEG5000匕例(B)、DPPA比例(C)、NaCl用量(D)作为自变量,以脂质微泡的浓度作为因变量,进行正交设计L9(34),筛选出脂质微泡UCAs的最优配方,为脂质UCAs的新药研发提供试验依据。2脂质微泡UCAs的理化特性评价2.1微泡外观形态观察取脂质微泡混悬液滴加于载玻片上,盖上盖玻片,于光学显微镜下观察其外观形态。2.2库尔特计数器检测采用50μm小孔管,0.9%NaCl电解液,分析体积500μl,粒径测量范围1.1μm～30μm。取微泡混悬液20μl,用生理盐水稀释5000倍,库尔特计数器测定微泡的浓度、平均粒径及其粒径分布。2.3全氟丙烷气体含量测定气相色谱-质谱联用仪测定制剂中全氟丙烷气体的含量。气相色谱条件：色谱柱为DB-5ms(30m×250μm×0.25μm),柱温35℃,载气为氦气,柱流速为0.8ml/min。质谱条件：EI电离源,倍增电压1900ev,选择离子：m/z(质荷比)69、169。样品处理：分别精密吸取2ml微泡溶液,注入装有500ml高纯氮气的采气袋内,于超声破碎仪上水浴超声10min使微泡完全破裂释放出OFP气体。吸取50μl进行气相色谱-质谱检测,外标法算出气体含量。2.4耐压稳定性用5ml注射器抽取4ml脂质微泡混悬液,通过三通管连接eagle4000监护仪,分别持续施加150mmHg、300mmHg压力1min、3min、5min、10min,再用库尔特计数器测量其浓度、粒径及分布。2.5液体制剂贮存稳定性制备脂质微泡6批,于4℃±2℃冰箱保存,分别于第0月,1月、2月、3月、6月取样品用库尔特计数器分析其浓度、平均粒径及分布,以研究液体微泡的贮存稳定性。3药效学评价3.1给药剂量选择取新西兰大白兔3只,分别耳缘静脉给药0.005、0.01、0.02、0.06、0.1ml/kg,分别进行肾脏、肝脏超声造影,随机安排各剂量组的给药次序,每个剂量组重复给药测定5次,记录图像数据至造影效果出现明显减退为止。采用仪器自带的分析软件Q-lab对图像进行分析。3.2造影效果评价取新西兰大白兔3只,脂质微泡UCAs给药剂量为0.01ml/kg,分别进行肾脏、肝脏超声造影,每个脏器检查重复3次,记录图像数据至造影图像廓清为止。采用仪器自带的分析软件Q-lab对图像进行分析。结果1按单因素试验考察脂质微泡制备工艺相关参数,得出全氟丙烷脂质微泡最佳的制备工艺参数为：剪切档数6档,通气时间30s,剪切时间2min。2按正交设计方法进行制剂处方优化实验,得出全氟丙烷脂质微泡最佳制备处方：磷脂总浓度为1×10-3mol/L, DPPE-PEG5000比例为8%,DPPA比例为10%,NaCl用量为4.5mg/ml。3按最优工艺制备的脂质微泡混悬液为白色乳状液,光学显微镜下可见微泡呈透亮球形,分布均匀,彼此无聚集现象。微泡浓度为(2.99±0.19)×109个/ml,平均粒径为(2.46±0.05)μm,97%微泡粒径小于7μm,OFP含量为(387.81±35.28)1μg/ml(每毫升脂质微泡OFP含量)。4微泡的耐压稳定性良好,耐受150mmHg压力后,各时间组浓度并无显著性差异(P=0.051)；耐受300mmHg压力后在5min和10min时与对照组(0min)相比浓度有显著性差异(P<0.001),但浓度仍大于2×109个/ml,仍能满足超声显影要求。5对脂质微泡混悬液进行6个月的稳定性考察,贮存于4±2℃冰箱中,在3个月内微泡浓度、平均粒径没有显著性变化(P均>0.05)。第6个月时,微泡的浓度和粒径都有所下降,与刚制备时(0月)相比差异显著(P<0.001),但浓度仍大于2×109个/ml,平均粒径也仍然满足最佳粒径要求。6药效学实验表明：脂质微泡UCAs最佳给药剂量为0.01ml/kg。脂质微泡给药剂量为0.01ml/kg时,所有实验兔均获得满意的肾脏、肝脏声学图像,造影剂填充均匀,与周围组织分界清晰。脂质微泡肾脏造影时,其峰值减半时间为603±47s,廓清时间为726±6s；肝脏造影时其峰值减半时间为388±97s,廓清时间为718±89s,可以满足临床应用要求。结论1用混合磷脂和全氟丙烷气体作基本原料,经高速剪切分散处理水合磷脂可制备出直径小于7μm、浓度大于2.0×109个/ml、稳定性较好的全氟丙烷脂质微泡。2使用库尔特颗粒分析仪测定脂质微泡的浓度、粒径及分布,方法简便可靠,是对脂质微泡进行质量控制的主要手段。3脂质微泡中全氟丙烷气体是其超声显影的主要成分,其含量是制剂质控的关键指标。气相色谱—质谱联用法测定全氟丙烷气体含量,具有简便、快速、灵敏、准确、精密度高等优点,可作为全氟丙烷类UCAs的有效质控手段。4低温保存有利于脂质微泡制剂的稳定。5制备的脂质微泡在体外具有良好的耐压能力,提示其在人体血管内应用后将有良好的稳定性,可以达到较好的造影效果。6制备的脂质微泡对新西兰大白兔肾脏、肝脏超声造影图像清晰,显影时间长,提示其在动物应用后具有良好的显影效果。