内质网钙库排空引起的通过钙库操控性钙通道的钙离子内流在大多数兴奋性细胞中也被证实为重要的钙离子内流途径。而Orai1蛋白作为钙释放激活性钙通道的组成亚基，广泛表达在哺乳动物的神经系统中。Orai1蛋白具有多种生理功能，例如：钙库操控性钙通道的组成部分、接受外来刺激的受体或蛋白相互作用的支架等。已有研究证实由钙库操控性钙通道介导的细胞内钙离子浓度升高会诱导神经细胞的分化，但是其相关机制少有研究。在本实验中，我们发现当用慢病毒敲除Orai1蛋白能够抑制PC12细胞突起形成，而且在大鼠皮质神经元中，神经元的树突棘出现缺失，生长锥对神经营养因子的反应消失。有趣的是，当我们用PKC的抑制剂GF109203x预处理细胞时，敲除Orai1蛋白对神经细胞分化的抑制作用会进一步增强；钙影像结果显示：GF109203x能够抑制Tg诱导的细胞外钙离子内流；Western结果显示，：GF109203x能够抑制PC12细胞的MAPK磷酸化；生长锥反应实验显示：GF109203x能使生长锥对神经营养因子的反应消失。因此，根据以上实验结果，我们推测Orai1蛋白对神经细胞的分化作用的影响与Rap1-MAPK和PKC信号途径相关，并且是保持神经细胞完整性和兴奋性的必要调节因子。因此，我们的研究中首次报道沉默Orai1对兴奋性细胞PC12细胞的分化、对原代培养的皮质神经元树突棘的形成、生长锥分化均有抑制作用。Orai1蛋白功能机制的探究很有可能成为神经系统相关疾病研究的新靶点。论文共包括三部分，其主要内容与结果如下：一．钙影像结果显示沉默Orai1的效果在PC12细胞被NGF诱导后更明显，而且PKC抑制剂GF109203X增强Orai1沉默效果利用沉默Orai1蛋白的稳定细胞系，实验在两种条件下进行，通过钙影像分析在Tg诱导下，SOCE的变化情况。首先，在未分化条件下，用PKC抑制剂GF109203x(GFx)预处理对照组（shconGFx）与正常对照组（shcon）相比，Δ340/380减少了48%（p<0.05）；用PKC抑制剂GF109203x(GFx)预处理沉默Orai1蛋白组（shOGFx）与未处理沉默Orai1蛋白组（shO）相比，Δ340/380变化幅度没有统计学意义；未处理沉默Orai1蛋白组（shO）与正常对照组（shcon）相比，Δ340/380减少了75%（p<0.001）；用PKC抑制剂GF109203x(GFx)预处理沉默Orai1蛋白组（shOGFx）与用PKC抑制剂GF109203x(GFx)预处理对照组（shconGFx）相比，Δ340/380减少了50%（p<0.001）。接着，在100ng/ml NGF刺激下，用PKC抑制剂GF109203x(GFx)预处理对照组（shconGFx）与正常对照组（shcon）相比，Δ340/380减少了25%（p<0.05）；用PKC抑制剂GF109203x(GFx)预处理沉默Orai1蛋白组（shOGFx）与未处理沉默Orai1蛋白组（shO）相比，Δ340/380减少了83%（p<0.05）；未处理沉默Orai1蛋白组（shO）与正常对照组（shcon）相比，Δ340/380减少了70%（p<0.001）；用PKC抑制剂GF109203x(GFx)预处理沉默Orai1蛋白组（shOGFx）与用PKC抑制剂GF109203x(GFx)预处理对照组（shconGFx）相比，Δ340/380减少了80%（p<0.001）。二．沉默Orai1抑制NGF诱导的PC12细胞neurite outgrowth生长，降低MAPK的磷酸化和Rap-GTP活化水平；PKC抑制剂GF109203x能够增强Orai1沉默的抑制功能利用沉默Orai1蛋白的稳定细胞系，同样在不同的两种条件下观察细胞形态。如图所示，在未分化条件下，shcon组细胞仅看到少量短突起，视为未分化。在100ng/ml NGF刺激下，根据分化阳性细胞选取原则：neurite outgrowth突起长度大于或等于胞体直径则视为分化阳性细胞。用PKC抑制剂GF109203x(GFx)预处理对照组（shconGFx）与正常对照组（shcon）相比，细胞分化程度降低45%；用PKC抑制剂GF109203x(GFx)预处理沉默Orai1蛋白组（shOGFx）与未处理沉默Orai1蛋白组（shO）相比，细胞分化程度降低50%。未处理沉默Orai1蛋白组（shO）与正常对照组（shcon）相比，细胞分化程度降低80%；用PKC抑制剂GF109203x(GFx)预处理沉默Orai1蛋白组（shOGFx）与用PKC抑制剂GF109203x(GFx)预处理对照组（shconGFx）相比，细胞分化程度降低80%。通过蛋白质免疫印迹法分析沉默Orai1蛋白的稳定细胞系中MAPK磷酸化水平和Rap1-GTP活化水平，用Tg预处理的细胞比未处理的细胞MAPK磷酸化程度增强，但是当沉默细胞内Orai1蛋白后，MAPK磷酸化程度减弱；当所有组别细胞均用GFx预处理后，用Tg预处理的细胞比未处理的细胞MAPK磷酸化程度明显增强，但是当沉默细胞内Orai1蛋白后，MAPK磷酸化程度明显减弱。用Tg预处理的细胞比未处理的细胞内Rap1-GTP水平升高，但是当沉默细胞内Orai1蛋白后，细胞内Rap1-GTP水平降低；当所有组别细胞均用GFx预处理后，用Tg预处理的细胞比未处理的细胞细胞内Rap1-GTP水平升高，但是当沉默细胞内Orai1蛋白后，细胞内Rap1-GTP的水平降低。三．大鼠皮质神经元原代培养中光镜观察到沉默Orai1神经元的轴突对NGF吸引反应消失，通过电镜观察沉默Orai1神经元的树突棘出现缺失一方面，NGF对沉默Orai1神经元生长锥的吸引反应消失。当用NGF刺激神经元30分钟后，对照组细胞生长锥有明显的转向反应。在沉默Orai1神经元组中我们并没有观察到生长锥的转向反应。在实验中生长锥只有长到一定长度后才能观察到明显的转向反应，因而我们在实验中只收集生长长度大于10μm的实验数据。另一方面，利用包装好的慢病毒shconRNA，shOrai1RNA感染原代大鼠皮质神经元，培养21天后观察树突棘密度；对照组神经元树突上的树突棘密集呈小头状，沉默Orai1神经元组则呈现出树突棘减少，甚至出现光滑的树突，统计学分析结果显示沉默Orai1蛋白后，神经元树突棘密度减少50%以上。