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子宫内膜癌(Endometrial cancer,EC)是女性生殖道三大恶性肿瘤之一,子宫内膜癌的发生率目前仅低于宫颈癌及乳腺癌。近十年来,我国内膜癌的发病率显著升高且年龄层趋于年轻化,对育龄期女性的健康构成巨大威胁。我们的前期临床研究发现,与正常子宫内膜组织相比,大部分的子宫内膜癌患者的癌组织中γ-神经突核蛋白(γ-Synuclein,SNCG)阳性率明显增高,且随患者的临床分期,肌肉组织浸润深度及淋巴结转移增加,癌组织切片SNCG蛋白的阳性率随之增高。SNCG阳性表达组的总生存率显着低于阴性表达组,提示SNCG异常表达可能与子宫内膜癌的发生,侵袭,转移以及预后相关。本次研究选取SNCG基因为靶点,利用RNA干扰(RNA Interference,RNAi)、慢病毒重组系统等技术构建人SNCG基因稳定沉默的子宫内膜癌HEC-1A细胞模型。通过CCK-8实验描绘细胞生长曲线、细胞克隆形成实验、划痕愈合实验、侵袭小室实验、检测细胞周期及细胞凋亡等流式技术实验深入探讨SNCG基因异常高表达与子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的关系。第一部分筛选SNCG蛋白高表达的人子宫内膜癌细胞胞株【目的】从各子宫内膜癌细胞株中筛选出SNCG蛋白异常高表达的细胞株,作为构建SNCG稳定沉默的细胞模型基础。【方法】利用肿瘤细胞传代培养人子宫内膜癌Ishikawa、HEC-1B、HEC-1A等细胞株,收集处于增生期的各子宫内膜癌细胞,进行总蛋白的提取。通过Western Blot印迹法检测上述各株子宫内膜癌细胞内的SNCG蛋白含量。【结果】利用肿瘤细胞传代培养、Western Blot印迹法等技术,筛选SNCG蛋白表达量较高的人子宫内膜癌HEC-1A细胞株,三株子宫内膜癌细胞株的SNCG蛋白表达量具有明显统计学差异(P<0.05)。【结论】人子宫内膜癌HEC-1A细胞中SNCG蛋白具有相对较高的表达水平,可作为我实验下一步慢病毒重组系统干扰SNCG基因,使之稳定沉默的细胞模型。第二部分慢病毒sh RNA载体构建并建立稳定转染的HEC-1A细胞株【目的】通过RNAi技术靶向抑制子宫内膜癌细胞HEC-1A中的SNCG基因表达,构建体外培养的人SNCG基因稳定沉默的子宫内膜癌HEC-1A细胞株。【方法】1.通过RNAi相关软件设计并合成3组特异性针对SNCG基因的sh RNA干扰序列,构建三组sh RNA慢病毒重组系统,并进行HEC-1A细胞转染。2.利用RT-PCR和Western Blot技术检测各组慢病重组系统干扰序列对SNCG基因的抑制效果,筛选出沉默效果最佳的慢病毒重组系统干扰序列。3.把SNCG-KD1作为最佳靶点干扰序列,并对其进行测序,测序成功后,包装成慢病毒sh RNA重组载体。4.经一定浓度的嘌呤霉素筛选后,获得SNCG稳定沉默的细胞模型,分别通过RT-PCR以及Western Blot技术检测SNCG-KD1 sh RNA慢病毒重组系统对人子宫内膜癌HEC-1A细胞株中SNCG基因的抑制效率。【结果】1.序列CCAAGGAGAATGTTGTACA,为通过RT-PCR以及Western Blot技术检测筛选出,所设计的最佳SNCG基因干扰靶点序列,命名为SNCG-KD1。2.经测序证实,成功构建慢病毒sh RNA载体系统,8x108TU/ml为包装成功后所检测的慢病毒滴度。3.慢病毒载体转染后的HEC-1A细胞,经嘌呤霉素筛选,通过RT-PCR以及Western Blot技术验证上述RNAi重组慢病毒系统对人子宫内膜癌细胞株HEC-1A中的SNCG基因的干扰效率:其中SNCG-KD1组的SNCG慢病毒载体抑制效果最佳,转染后SNCG m RNA的水平相对HEC-1A细胞降至(3.3±1.94)%,转染后蛋白的水平相对对照组SNCG蛋白表达量(1.46±0.75)%,(P<0.05)。【结论】成功构建人SNCG基因稳定沉默的人子宫内膜癌HEC-1A细胞模型,通过RNA干扰及慢病毒重组技术,可有效地抑制子宫内膜癌细胞系HEC-1A中的SNCG基因的表达,为后续SNCG基因与其恶性生物学行为关系的研究实验,奠定细胞模型基础。第三部分慢病毒介导的SNCG基因沉默对子宫内膜癌细胞HEC-1A的体外影响【目的】利用所构建的人SNCG稳定沉默的子宫内膜癌HEC-1A细胞,作为本章节的细胞模型,通过观察基因沉默前后内膜癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力的变化,以及SNCG基因稳定沉默后对HEC-1A细胞周期和细胞凋亡的影响,为进一步研究SNCG基因沉默后对子宫内膜癌细胞HEC-1A的潜在机制奠定生物功能学变化的基础。【方法】1.利用重组慢病毒SNCG-KD1和空质粒载体慢病毒系统转染人子宫内膜癌细胞。将实验对象分为三组:SNCG-KD1组:sh RNA慢病毒载体系统处理后的人SNCG稳定低表达的子宫内膜癌HEC-1A细胞;对照组:不做任何处理的子宫内膜癌HEC-1A细胞;空转染组:转染空质粒慢病毒载体系统的HEC-1A细胞。2.通过CCK-8试剂盒对细胞生长曲线的进行测定并描绘,分别检测实验组和对照组、空转染组细胞增殖情况,分析SNCG基因沉默前后对HEC-1A细胞群体增殖的影响。3.通过细胞体克隆形成实验,分析SNCG基因沉默前后对HEC-1A单个细胞增殖生长的影响。4.通过划痕法各检测实验组和对照组细胞、空转染组细胞体外迁移能力,分析SNCG基因沉默前后,观察HEC-1A细胞的体外迁移能力的变化。5.通过侵袭小室法,检测实验组、对照组细胞、空转染组细胞体外侵袭能力,分析SNCG基因沉默后,体外培养的HEC-1A细胞侵袭能力的变化及其相关性。6.通过PI-FACS实验分别观察上述三组实验组的细胞生长周期变化,观察SNCG基因沉默后,人子宫内膜癌HEC-1A细胞生长周期的变化。7.通过Annexin-V&PI双染色定量分析上述三组实验组细胞凋亡的变化,分析SNCG基因沉默后,人子宫内膜癌HEC-1A细胞株的细胞凋亡的变化。【结果】1.通过细胞生长曲线的测定(CCK-8试剂盒)结果显示:SNCG-KD1慢病毒转染HEC-1A细胞后,空转染组的细胞倍增时间与对照组相比较差别无统计学意义(P>0.05);SNCG-KD1组细胞的倍增时间较对照组明显减慢(P<0.05)。2.细胞克隆形成实验结果显示,体外培养的慢病毒转染HEC-1A细胞,空转组的细胞克隆百分比与对照组差别不具有统计学意义(P>0.05);子宫内膜癌细胞SNCG-KD1组比对照组细胞克隆数目下降,且差别具有统计学意义(P<0.05);SNCG-KD1组比空转染组细胞克隆百分比减少,且差别具有统计学意义(P<0.05)。3.细胞划痕法结果显示,空转染组的8小时,24小时迁移率(%)与对照组差别无统计学意义(p>0.05);SNCG基因稳定沉默后,子宫内膜癌细胞SNCG-KD1组比对照组24小时迁移率(%)下降,差别有统计学意义(P<0.05);SNCG-KD1组比空转染组的划痕24小时迁移率减少,差别有统计学意义(P<0.05)。4.侵袭小室法结果显示,空转染组的侵袭迁移率(%)与对照组差别无统计学意义(P>0.05);SNCG基因稳定沉默后,子宫内膜癌细胞SNCG-KD1组比对照组侵袭迁移率降低(%)下降(P<0.05);空转染组的侵袭迁移率比实验组的侵袭迁移率显著增高(P<0.05)。5.细胞生长周期实验结果显示:空转染组与对照组相比较,各细胞周期比例无明显统计学差异(P>0.05)。SNCG基因稳定沉默后体外培养的人子宫内膜癌细胞株HEC-1A,实验组较对照组的G1,G2/M期比率显著增高(P<0.05)。6.细胞凋亡结果显示:空转染组的细胞总调亡率(%)与对照组差别无统计学意义(P>0.05);sh RNA慢病毒转染HEC-1A细胞后,子宫内膜癌细胞SNCG-KD1组比对照组总调亡率(%)下降,差别有统计学意义(P<0.05);SNCG-KD1组比空转染组总调亡率(%)增加(P<0.05)。【结论】体外培养的人SNCG基因稳定沉默的子宫内膜癌HEC-1A细胞株的恶性生物学行为如细胞的增殖、迁移、侵袭能力显著减弱,同时,子宫内膜癌HEC-1A细胞株中SNCG稳定沉默后,肿瘤细胞周期停滞于G1,G2/M期,提示SNCG基因的异常过表达可能与体外培养的人子宫内膜癌细胞株HEC-1A的细胞周期密切相关,推测体外培养的子宫内膜癌细胞中的SNCG基因有可能成为子宫内膜癌分子治疗的潜在靶点。