研究背景：急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤之一,也是成人常见的急性白血病类型之一,发病年龄有两个高峰期,即2至5岁的儿童和大于50岁的成人。ALL是一种起源于B或T系淋巴干祖细胞的异常克隆性疾病,在临床、细胞遗传学及分子生物学均具有高度异质性。近年来,随着大剂量多药联合化疗方案、分子靶向治疗药物和造血干细胞移植的应用,儿童ALL的治愈率可达80%以上,而成人ALL的治疗效果仍然较差,5年无病生存期(disease-free survival,DFS)仅为30～40%,因此临床上迫切需求提高成人ALL的总生存期(overall survival, OS)和无病生存期(disease-free survival,DFS)。相对于儿童而言,成人ALL的发病年龄偏大、基础疾病及不良预后因素多,因此对于目前的治疗策略如大剂量多药联合化疗和造血干细胞移植等方案尚不能满足临床治疗的需要,此外,多药联合化疗和造血干细胞移植的并发症及死亡率相对较高,因此寻求一种高效低毒的药物显得尤为迫切。双硫仑(Disulfirum,DS)是一种临床上应用60多年的抗酗酒药物,具有安全性好、毒副作用小且价格低廉等多种特性。近年来,越来越多的研究者发现DS对乳腺癌、脑胶质细胞瘤、前列腺癌、黑色素瘤及结肠癌等多种实体瘤具有抗肿瘤作用。进一步研究还表明DS是一种强的金属离子螯合剂,能够与多种金属离子结合如Zn、Cu和Ni等形成复合物而增强其肿瘤杀伤作用。Cu是生物有机体一种必需的微量元素,其对于机体内许多关键酶和转录因子活性的发挥具有至关重要的作用。许多研究发现,DS与Cu结合形成Cu(deDTC)2复合物能够增强DS的肿瘤杀伤作用。虽然目前许多研究者已经证实了DS/Cu对许多恶性肿瘤包括实体瘤和血液系统恶性疾病具有明显的诱导凋亡和抑制增殖作用,但关于其对急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞作用的相关报道却很少。由于ALL 80-85%起源于B细胞,因此本研究将探讨DS联合Cu对B-ALL细胞(包括原代BALL细胞和Nalm6细胞株等)的杀伤作用及其分子机制。细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death,PCD),是指由基因调控的细胞自主有序的死亡,对于维持内环境的稳定、多个系统的发育以及生物进化等过程中起着重要作用。机体内主要存在有三条途径,一条是死亡受体介导的凋亡通路(又称外源性凋亡通路),另外一条是线粒体相关的凋亡通路(内源性凋亡通路),最后是内质网通路,其中线粒体凋亡通路被认为是最经典的凋亡途径。线粒体是细胞生命活动控制中心,它既是细胞呼吸和氧化磷酸化的中心,又是细胞凋亡的调控中心。线粒体介导的细胞凋亡主要是由于各种刺激的作用(包括阴性和阳性刺激两大类,阴性刺激因子主要指的是由于各种生长因子、激素和细胞因子的缺乏所致；阳性刺激包括射线、药物、细胞毒素、缺氧及病毒感染等多种因素)使线粒体内膜上的通透性转换孔道-线粒体通透性转换孔(Mitochondrial permeability transition pore, MPTP)开放,导致线粒体膜通透性发生改变、线粒体膜电位(mitochondrial membrance potential, MMP/ΔΨ)下降,从而使线粒体膜间隙(mitochondrial intermembrane space,IMS)存在的大量的凋亡相关因子释放至胞浆或胞核内,包括细胞色素C、Smac/DIABLO、Htra2/Omi、IAPs、AIF及核酸内切酶G(EndoG)等,从而诱导Caspases家族蛋白酶的活化,随后Caspases切割其底物蛋白(这些蛋白大多是细胞内的功能蛋白,在DNA修复、mRNA裂解、类固醇合成及细胞骨架重建等过程中起着重要的作用),并使这些作用底物蛋白的功能丧失,最终导致细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白根据其功能和BH结构域数目的不同而分成三大亚类：1)抗凋亡蛋白亚家族：是指具有4个BH结构域(BH1-4)的Bcl-2和Bcl-xL;2)促凋亡蛋白亚家族：指其蛋白结构中包含有3个BH结构域(BH1-3)的BAX和BAK等；3)仅具有BH3结构域的促凋亡蛋白亚家族：如BID和BIM。这三类Bcl-2亚家族蛋白之间相互可形成同源或者异源二聚体,形成的二聚体是其家族蛋白之间功能实现和功能调节的重要形式。大量的实验研究表明Bcl-2家族蛋白在调控线粒体膜电位的变化中发挥着重要的的作用,从而在调控细胞凋亡作用方面发挥着不可或缺的角色。Bcl-xL、Bcl-2蛋白同属于Bcl-2抗凋亡蛋白亚家族,两者在细胞抗凋亡作用方面起着协同作用,共同抑制细胞凋亡,延长细胞寿命。Bcl-2基因(即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因)是一种原癌基因(oncogene),最早是由Tsujimoto Y等于1984年在滤泡性非霍奇金淋巴瘤(Follicular non-hodgkin’s lymphoma)患者中首先发现的,是由于t(14；18)(q32；q21)染色体异位所致,其编码的Bcl-2蛋白是体内最重要的抗凋亡蛋白之一。Bcl-2蛋白在不同的细胞内可以有不同的亚细胞定位,如分布于线粒体、内质网及核膜等部位上,其高表达能够抑制细胞的凋亡,延长细胞寿命。Bcl-xL(BCL2L1)是一种位于线粒体外膜的跨膜蛋白(tansmembrane protein),能调控线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道蛋白质(voltage-dependent anion channel,VDAC)的开放和关闭,进而影响线粒体膜通透性和线粒体膜电位的变化,最终对线粒体凋亡过程产生影响。其同样也属于Bcl-2抗凋亡蛋白亚家族,与Bcl-2协同抗凋亡作用,促进细胞存活。目前关于DS/Cu抗肿瘤作用的分子机制尚不完全明确,大部分研究主要围绕蛋白酶体抑制和JNK/c-Jun通路的活化等方面,其他还包括抑制血管生成、Ras/PI3K/mTOR通路及抑制MDR蛋白等多方面。本研究团队前期也已经证实了DS/Cu可通过抑制NF-κB、活化JNK/c-Jun通路、诱导ROS在细胞内蓄积从而诱导急性髓系白血病KG-1a细胞、急性T淋巴细胞白血病Molt4细胞和Brukitt淋巴瘤Raji细胞凋亡并抑制其增殖,且能逆转HL-60耐药细胞株对多柔比星的耐药。目前有关DS/Cu对于急性B淋巴细胞白血病细胞的杀伤作用及其分子机制的研究尚少,有研究报道发现线粒体凋亡通路(mitochondrial pathway)在DS/Cu诱导其他肿瘤细胞凋亡及抑制增殖过程中发挥着重要的作用,因此本研究将以B-ALL细胞株(Nalm6细胞)和原代B-ALL细胞为研究对象,探讨DS/Cu对急性B淋巴细胞白血病细胞细胞Nalm6及原代B-ALL细胞的杀伤作用及其与线粒体凋亡通路之间的关系。研究目的：本实验以急性B淋巴细胞白血病Nalm6细胞株、原代B-ALL细胞为研究对象,探讨DS/Cu是否能诱导急性B淋巴细胞白血病细胞凋亡并抑制其增殖；并进一步研究DS/Cu诱导急性B淋巴细胞白血病细胞凋亡与线粒体凋亡通路之间的关系。研究方法：1、用CCK-8(cell counting kit-8)法检测不同浓度的(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4uM)DS联合0.5uM的Cu作用24h后对Nalm6细胞的增殖抑制作用,并用graph prism5软件计算出相应的IC50值。2、用Annexin-V/PI双染法流式细胞术检测不同浓度的(0.025、0.05、0.1、0.2、0.5uM) DS联合0.5uM的Cu处理24h后对Nalm6、原代B-ALL细胞凋亡的影响。3、用甲基纤维素集落形成(colony-forming unit,CFU)实验检测DS及DS/Cu对Nalm6细胞集落形成能力的影响；4、用JC-1法检测不同浓度的(0.025、0.05、0.1、0.2、0.5uM)DS联合0.5uM的Cu处理12h后对Nalm6、原代B-ALL细胞线粒体膜电位的影响。5、利用蛋白免疫印迹法检测DS、DS/Cu作用Nalm6细胞12h后引起线粒体凋亡通路相关蛋白：Bcl-2、Bcl-xL、Caspase-3和PARP等的表达变化。6、采用SPSS19.0软件进行统计学分析,多组间均数比较使用多个独立样本的非参数检验或单因素方差法进行统计(方差不齐时考虑Welch校正),方差齐时考虑使用LSD(方差齐性)进行多重比较,不齐时采用Dunnett’s T3方法进行多重比较；计量资料用Mean±SD表示,检验水准为α=0.05,所有检验均为双侧检验。由于样本量较小,当参数检验与非参数检验结果不一致时,以非参数检验的结果为准,并采用Bonferroni法校正检验水准进行多重比较；两种方法结果一致时,采用参数方法的结论。研究结果：1、CCK-8细胞毒性实验结果显示DS/Cu对Nalm6细胞具有明显的增殖抑制作用：作用24h后,单药Cu(0.5uM)组的增殖抑制率为(6.39±4.93)%,与对照组比较差异无统计学意义(t=-2.244,P=0.088)。而不同浓度的DS/Cu对Nalm6细胞均具有显著的增殖抑制作用,且呈剂量依赖性,0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4uM的DS联合0.5uM的Cu对nalm6细胞的增殖抑制率分别为(22.29±6.69)%、(48.66±11.58)%、(50.83±12.61)%、(59.24±4±9.43)%、(62.74±9.17)%、(66.7±7.64)%、(72.13±7.94)%、(77.86±5.43)%,单因素方差分析表明与对照组比较差异均具有统计学意义(均P<0.05),由graph prism5软件计算24h的IC50浓度为(0.18±0.08)uM。2、流式细胞术Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡的结果显示DS/Cu对Nalm6细胞具有显著的凋亡诱导作用：单药Cu(0.5uM)组作用于Nalm6细胞24h后凋亡比例为(7.82±5.13)%,与对照组(8.34±6.23)%相比差异无统计学意义(t=0.112,P=0.916)。而不同浓度的(0.025、0.05、0.1、0.2/0.5uM)DS联合0.5uM的Cu对Nalm6细胞具有显著的凋亡诱导作用,凋亡比例分别为(17.84±7.68)%、(31.39±5.86)%、(60.41±13.87)%、(69.26±13.29)%、(81.37±12.72)%,经单因素方差分析表明,不同浓度DS/Cu均能诱导Nalm6细胞凋亡,与对照组(8.34±4±6.23)%比较差异具有统计学意义(F=28.471,P=0.000)。进一步用LSD方法比较不同浓度DS/Cu两两组间的细胞凋亡比例的差异结果显示：0.025uM组与0.1、0.2、0.5uM组间均有明显的统计学差异(均P<0.01)；0.05uM与0.1、0.2、0.5uM组间差异具有显著统计学意义(均P<0.01)；0.1uM与0.5uM组间差异也具有明显统计学意义(P<0.05)；余各组间差异无统计学意义。3、DS/Cu对原代B-ALL细胞亦具有诱导凋亡的作用：本实验通过对16例原代B-ALL细胞的研究发现,DS/Cu对不同患者来源的原代B-ALL细胞均有不同程度的凋亡诱导作用,亦呈剂量依赖性。单药Cu(0.5uM)组作用24h后的凋亡比例为(34.66±16.99)%,与对照组(33.82±15.25)%相比差异无统计学意义(t=0.146,P=0.885);而不同浓度的(0.025、0.05、0.1、0.2、0.5uM)DS联合Cu(0.5uM)作用24h后的凋亡比例分别为(43.0±15.93)%、(57.02±23.8)%、(64.82±24.03)%、(70.22±22.2)%、(68.09±22.72)%,方差分析表明,与对照组相比差异具有统计学意义(F=9.392,P=0.000)。用LSD方法比较不同浓度DS/Cu两两组间的细胞凋亡比例的差异结果显示：0.025uM组与0.1、0.2、0.5uM组间均有明显的统计学差异(均P<0.01)；余各组间差异无统计学意义。于B-ALL患者之间的一些临床生物学特征存在着不同程度的差异性,而这些差异可能会影响DS/Cu对原代B-ALL细胞的杀伤作用,故本研究将从B-ALL患者的年龄、起病时白细胞(white blood cell,WBC)数、免疫分型、危险分层、细胞遗传学及Ph染色体等多方面来探讨这些因素对DS/Cu疗效的影响。经析因分析统计结果表面,患者的起病时的WBC数及免疫分型等三个因素可能会影响DS/Cu的疗效,起病时WBC>=30*109/L患者的凋亡比例较WBC<30*109/L高(F=3.966,P=0.049),免疫分型的Pro-B组的细胞凋亡比例较non-ProB高(F=6.149,P=0.015)。而其他临床生物学特征,如患者的年龄、危险分层、遗传学改变及Ph染色体等,均不影响DS/Cu对原代B-ALL细胞诱导凋亡的作用。但由于本实验仅研究16例患者来源的原代B-ALL细胞,样本量偏少,故以上结果可能存在一定的偏差,需要扩大样品量来进一步验证本实验的结果。4、CFU(甲基纤维素集落形成)实验结果提示DS/Cu能够抑制Nalm6细胞的集落形成：对照组、Cu、DS和DS/Cu组的集落形成百分比分别为(33.63±4.15)%、(30.93±4.22)%、(10.83±2.63)%、(0.9±0.66)%。经统计分析的结果表明,与对照组相比,单药Cu(0.5uM)组并不能抑制Nalm6细胞的集落形成,两者之间差异无统计学意义(t=0.791,P=0.473)；而DS和DS/Cu组能显著抑制集落形成,单因素方差分析表明,与对照组相比差异具有明显的统计学意义(F=70.949,P<0.001)；进一步用LSD分析表明,DS与DS/Cu组间亦存在明显的差异(P=0.006),DS/Cu组抑制Nalm6细胞集落形成能力更强。5、用线粒体膜电位检测试剂盒(Mitochondrial membrane potential detection kit:JC-1 kit)检测DS/Cu作用12h后对B-ALL细胞(包括Nalm6和原代B-ALL细胞)线粒体膜电位(mitochondrial membrance potential,MMP/AΔΨ)的影响发现：对Nalm6细胞作用12h后,单药Cu (0.5uM)组的JC-1多聚体/单体平均荧光强度的比值为(1.01±0.09),与对照组(1.21±0.36)相比差异无统计学意义(t=-0.996,P=0.375)；而不同浓度的(0.025、0.05、0.1、0.2、0.5uM)DS联合0.5uM的Cu作用于Nalm6细胞12h后JC-1多聚体/单体平均荧光强度的比值分别为：(1.01±0.15)、(0.64±0.22)、(0.39±0.25)、(0.21±0.11)、(0.11±0.07),经方差分析发现,不同浓度的DS/Cu可致Nalm6细胞线粒体膜电位水平下降,与对照组比较差异具有统计学意义(F=14.535,P=0.000)。用LSD方法比较不同浓度DS/Cu两两组间的线粒体膜电位变化的差异结果显示：0.025uM组与0.05、0.1、0.2、0.5uM组间均有明显的统计学差异(均P<0.05)；0.05uM与0.2、0.5uM组间差异具有显著统计学意义(均P<0.05)；余各组间差异无统计学意义。本研究还发现DS/Cu对不同患者来源的7例原代B-ALL细胞线粒体膜电位的影响与Nalm6细胞相似,单药Cu(0.5uM)组作用12h后JC-1多聚体/单体的比值为(1.75±1.3),与对照组(1.69±1.04)相比差异无统计学意义(t=-0.099,P=0.923)；而不同浓度的(0.025、0.05、0.1、0.2、0.5uM)DS联合0.5uM的Cu作用于原代B-ALL细胞12h后JC-1多聚体/单体的比值分别为：(1.3±0.78)、(1.02±0.71)、(0.68±0.64)、(0.36±0.34)、(0.15±0.12),经方差分析表明,不同浓度的DS/Cu均能引起原代B-ALL细胞线粒体膜电位水平不同程度的下降,与对照组相比差异具有统计学意义(F=7.33,P<0.01)；6、蛋白免疫印迹法发现DS/Cu可能是通过影响线粒体凋亡通路相关蛋白的表达变化从而诱导细胞凋亡：对照组、Cu. DS和DS/Cu组作用于Nalm6细胞24h后收集细胞,用蛋白免疫印迹法检测发现DS/Cu能下调Bcl-2、Bcl-xl等蛋白的表达,进而活化Caspase3等蛋白水解酶,降解其作用底物PARP蛋白,最终诱导细胞凋亡。结论：1、不同浓度的DS/Cu对Nalm6细胞具有显著的增殖抑制作用,且呈剂量依赖性,24h的IC50为(0.18±0.08)uM。2、不同浓度的DS/Cu能显著诱导B-ALL细胞(包括Nalm6和原代B-ALL细胞)凋亡,呈剂量依赖性；同时DS/Cu能明显的抑制Nalm6细胞集落形成。3、DS/Cu可以通过降低B-ALL细胞(包括Nalm6和原代B-ALL细胞)内线粒体膜电位(MMP)水平,下调Bcl-2、Bcl-xl等线粒体凋亡通路相关蛋白的表达,活化Caspase-3、水解PARP等底物蛋白,最终诱导B-ALL细胞凋亡。