鸡传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBV主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统。病鸡出现呼吸困难、产蛋下降、肾炎和腺胃炎等症状和病变。IBV的特点是变异频繁,血清型复杂,所致疾病的临床表现差异很大。常规的诊断方法存在一定的局限性,新的分子生物学诊断方法成为近年来研究的热点。以前,人们对IBV的研究主要集中在S1基因上;但进一步的研究发现,IBV的其他结构蛋白也有重要的生物学功能。近年来,我国鸡传染性支气管炎的流行呈上升趋势,尤其是肾型、腺胃型鸡传染性支气管炎已造成了巨大的经济损失。许多学者认为大量变异株的出现与不规范使用活疫苗有关,但目前有关我国IBV地方流行株的基因序列数据还不够充分,分子生物学方面的研究也还不够深入。为了探索IBV血清型复杂多变的原因及基因工程诊断试剂的研制,本研究对IBV HN99国内分离株的N基因进行了克隆、序列分析、原核表达及表达产物的免疫活性检测;对IBV HN99株的M基因进行了克隆、序列分析及真核表达,为我国IB的诊断及免疫提供科学依据。1.根据GenBank中已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增IBV HN99株的N基因,并将其克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌Top10,提取pMD18-T-N重组质粒,进行酶切和PCR鉴定,并对阳性质粒进行测序,将测序结果与H52、Ark99、BJ等参考毒株进行序列分析。结果表明,N基因全长为1230 bp,编码一条409个氨基酸组成的多肽;其核苷酸与H52,Ark99和BJ等毒株的同源性为88.4%～90.7%,氨基酸同源性为91.7%～94.4%;HN99株与H52,Ark99和BJ等其他各毒株的亲缘关系较远,是一株新的IBV变异株。2.通过RT-PCR扩增HN99株和W株的M基因并测序,将这2个毒株的M基因与GenBank中毒株M基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较,并建立M基因系统发育树。结果表明:HN99株M基因全长为669 bp,编码222个氨基酸残基,HN99株存在碱基插入与缺失,而W株M基因全长为681 bp,编码226个氨基酸残基,W株有碱基插入;HN99株与GDS14、M41、Gray、H52、BJ等毒株的M基因核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性分别为87.0%～90.3%和89.7%～94.2%,W株与HN99、M41、Gray、H52、BJ等毒株的M基因核苷酸同源性及其推定的氨基酸分别为88.2%～92.7%和91.1%～95.6%。遗传进化树显示W株与BJ亲缘关系近,HN99株与其他毒株亲缘关系均较远。3.鸡传染性支气管炎病毒HN99株膜蛋白(M)基因PCR产物经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,克隆入杆状病毒真核表达载体pF-MBP。将构建的重组表达质粒pF–MBP/M转化到DH10BAC-eGFP菌中,然后用脂质体转染法将重组质粒Bacmid-egfp-MBP/M转染Sf9细胞。盲传两代后,倒置显微镜下可见转染的Sf9细胞比正常细胞折光性增强,细胞核增大,细胞增大最后破裂;在荧光显微镜下观察可见细胞浆内有绿色的荧光。提取病变Sf9细胞的DNA,分别用M13引物、特异性引物进行PCR鉴定,从病变细胞中扩增出特异性片段,表明已经产生重组病毒。M基因的表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测结果显示,重组病毒蛋白条带大小约为68 ku,与预期结果一致。4.鸡传染性支气管炎病毒HN99株核蛋白(N)基因PCR产物经BamHⅠ、HindⅢ双酶切,分别克隆入大肠杆菌原核表达载体pMAL?-p2X、pMAL?-c2X、pET28a,构建重组表达载体,经IPTG诱导之后,选择表达量最大的pMAL?-p2X-N做进一步的蛋白纯化、鉴定及表达产物的免疫活性检测。将重组表达质粒pMAL-p2X-N,转化大肠杆菌TB1并进行诱导表达;通过pMAL?融合蛋白纯化系统对表达产物进行非变性纯化,将纯化的N蛋白按常规方法免疫新西兰大白兔,制备兔抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的多克隆抗体,并用ELISA检测其生物活性。结果表明,重组质粒pMAL?-p2X-N经IPTG诱导,表达的重组核蛋白纯化后相对分子质量分别约为92 ku和82 ku,82 ku的蛋白可能是92 ku蛋白的裂解产物,与Western blot出现的两条蛋白带相一致;纯化的重组蛋白经麦芽糖标签裂解因子作用后,出现两条蛋白带,相对分子质量分别为45 ku和35 ku,说明融合蛋白中的标签已被切除,得到了纯度较高的N蛋白,与预期结果相符合;制备的多克隆抗体可与不同鸡传染性支气管炎病毒株发生反应,与亲本毒株的反应性高于与其他毒株的反应性。综上所述,IBV HN99株N、M基因核苷酸序列均发生了一定程度的变异,与其他参考株亲缘关系均较远,是一株新的IBV变异株。IBV HN99株N基因在原核系统中获得了成功表达,表达的可溶性N蛋白具有高度的生物活性,有望做为新的基因工程抗原用于鸡传染性支气管炎病毒的群特异性诊断;IBV HN99株M基因在带有绿色荧光蛋白标签的真核系统中获得了成功表达;IBV W株M基因存在碱基插入现象,序列发生了变异。本研究为IBV的研究补充了新的试验数据,为预防和控制IB提供了新的资料和科学依据。