红曲菌（Monascus spp.）是一种小型丝状真菌,因其在生长过程中能分泌多种代谢产物如红曲色素、Monacolin K、淀粉酶及麦角甾醇类等物质而有着广泛的应用,涵盖食品着色、食品发酵及医疗保健等方面。组蛋白乙酰化修饰的变化可以改变组蛋白与DNA的亲和力影响基因转录活性,进而导致基因的表达强度和后续一系列生物过程的变化。组蛋白去乙酰化酶通过降低乙酰化水平来抑制基因的表达。其中,Sir2是一类从古细菌到哺乳动物都保守的NAD+依赖型的去乙酰化酶。对丝状真菌中Sir2的功能研究表明,它在真菌的生长发育及次级代谢调控等方面发挥着重要作用。前期研究结果表明,外源添加Sir2蛋白家族抑制剂二氢香豆素对红色红曲菌M7的初级代谢和色素种类具有明显的影响,同时也已成功构建了Mrsir2缺失株ΔMrsir2。本研究在此基础上以Mrsir2为研究对象,以原始菌株M7和敲除菌株ΔMrsir2为研究材料,通过转录组信息分析、表型观察、生理生化实验等手段对红色红曲菌中的Sir2的功能进行初步探索,同时采用原位回补的方法构建得到2种Mrsir2的回补菌株ΔMrsir2::Mrsir2和ΔMrsir2::PalcA-Mrsir2。主要研究结果如下:1.基于RNA-seq技术分析ΔMrsir2菌株的转录组信息对原始菌株M7和敲除菌株ΔMrsir2在PDB中培养3 d和7 d的样品进行RNA测序,通过基因功能注释和比对,依据GO和Pathway分析结果,分析了ΔMrsir2菌株不同生物过程中DEGs表达水平的变化。结果表明Mrsir2的缺失对菌株M7其他的组蛋白乙酰化相关酶的表达没有显著影响。在生长发育早期（3 d）,Mrsir2能负调控红曲菌生长的糖酵解过程,但对M7菌株中已知的产孢调节基因的表达水平影响不大,其缺失会引起抗氧化酶和红曲色素聚酮合酶表达上调。培养7 d时,ΔMrsir2菌株中参与麦角甾醇合成的多个基因表达整体下调。2.对ΔMrsir2菌株的生长代谢及环境胁迫进行了分析M7菌株和ΔMrsir2菌株在PDA、CYA和G25N平板上的菌落形态及显微形态无明显差异;扫描电镜500倍观察PDA平板上的菌丝体,结果显示ΔMrsir2菌株的分生孢子产生时间和菌丝体自溶时间比原始菌株M7提前。PDB液态发酵结果表明,M7菌株和ΔMrsir2菌株的生长趋势一致,在葡萄糖的消耗速度上ΔMrsir2菌株略快于M7菌株,第2 d时ΔMrsir2菌株的生物量显著高于M7菌株,之后无显著性差异;ΔMrsir2菌株和M7菌株的胞内外色价并无显著性差异。UPLC分析红曲米中主要色素及麦角甾醇测定的结果表明,M7菌株和ΔMrsir2菌株的色素组分并无差异,在含量上黄色素Monascine在M7菌株和ΔMrsir2菌株中没有显著性差异,另外四种色素在ΔMrsir2菌株中的产量均高于M7菌株;第8 d和第10 d时ΔMrsir2菌株的麦角甾醇含量较M7菌株低但没有显著性差异。环境胁迫分析结果表明,M7菌株和ΔMrsir2菌株的总SOD酶活力和CAT酶活力没有显著性差异,相比CAT,SOD在红色红曲菌M7的抗氧化防御系统中起到更重要的作用;一定浓度的氧化剂、高渗剂和细胞壁抑制剂均会在不同程度上抑制红曲菌的生长,其中ΔMrsir2菌株对氧化剂甲萘醌和H2O2的耐受性比M7菌株强,对高渗剂甘油、Na Cl以及细胞壁合成抑制剂刚果红的耐受性均无明显差别。根据以上测定结果,推测Mrsir2在红曲菌分生孢子发育、生长速度、色素产生和氧化应激方面具有调节作用。3.构建了回补菌株ΔMrsir2::Mrsir2和ΔMrsir2::PalcA-Mrsir2利用cDNA末端快速扩增技术得到Mrsir2基因的全长cDNA序列,其中ORF长1539 bp,编码512个氨基酸,主要含有一个Sir2的保守结构域,不含信号肽和跨膜区,主要在胞内发挥作用,可能是一种穿梭蛋白,主要定位于细胞质。系统进化分析表明Mr Sir2属于Ia类sirtuin。以潮霉素B抗性基因（hph）为筛选标记,采用double-joint PCR构建了5’UTR-Mrsir2-hph-3’UTR和5’UTR-hph-alc A promoter-Mrsir2-3’UTR这2种回补盒,将其连入质粒p CAMBIA3300中,构建基因回补载体,将回补载体质粒转入根癌农杆菌EHA105中,借助农杆菌介导的红曲菌转化技术将回补盒整合到ΔMrsir2菌株的基因组中,得到Mrsir2基因的回补菌株ΔMrsir2::Mrsir2和ΔMrsir2::PalcA-Mrsir2。表型分析显示两者表现出了不同的性状,其中回补菌株ΔMrsir2::PalcA-Mrsir2的表型与M7菌株更为相似。