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目的:1.观察自噬水平在睾丸癌细胞对顺铂耐药中的变化。2.明确自噬在睾丸癌细胞对顺铂耐药产生中的作用。方法:1.Western blotting法检测细胞内LC3、p62、Atg5、Atg7蛋白表达。2.mCherry-GFP-LC3B质粒转染检测细胞自噬水平。3.透射电子显微镜观察自噬体。4.MTT法检测细胞存活。5.PI单染法检测细胞死亡。6.集落克隆法检测细胞克隆形成能力。7.shRNA转染对自噬相关基因atg5、atg7进行干扰,G418筛选培养基建立稳转株。8.统计学方法:采用SPSS 16.0统计软件进行相关实验数据资料的分析,实验结果以均数±标准差(Mean±SD)表示,两组之间均数比较采用两样本t检验,两组以上均数比较采用单因素方差(One-way ANOVA)分析和SNK-q检验。统计图表采用GraphPad Prism 5.0绘制,P<0.05差异具有统计学意义。结果:1.使用顺铂处理后,耐顺铂睾丸癌细胞I-10/DDP中自噬水平增加,而在亲代睾丸癌细胞I-10中自噬水平无明显变化。Western blotting结果显示相比于亲代睾丸癌细胞I-10,耐顺铂睾丸癌细胞I-10/DDP经顺铂处理后,LC3-II蛋白表达量明显增加(P<0.001),p62蛋白表达量明显降低(P<0.05);透射电子显微镜观察发现相比于亲代睾丸癌细胞I-10,耐顺铂睾丸癌细胞I-10/DDP经顺铂处理后自噬体的数量明显增加;激光共聚焦显微镜观察发现经mCherry-GFP-LC3B瞬时转染的耐顺铂睾丸癌细胞I-10/DDP在顺铂处理后可见细胞内自噬体和自噬溶酶体的数量均增加。2.氯喹抑制顺铂介导的自噬作用透射电子显微镜观察发现氯喹与顺铂合用组细胞中的自噬体的数量较单用顺铂组细胞明显增加;激光共聚焦显微镜观察发现氯喹与顺铂合用组细胞内自噬体和自噬溶酶体的数量较单用顺铂组细胞中增加。3.氯喹增强耐顺铂睾丸癌细胞I-10/DDP对顺铂的敏感性。MTT结果表明与单用顺铂组相比,氯喹与顺铂合用组的细胞存活率降低(P<0.05);PI单染法结果表明与单用顺铂组相比,氯喹与顺铂合用组的细胞死亡率增加(P<0.001);集落克隆实验的结果表明与单用顺铂组相比,氯喹与顺铂合用组的细胞克隆形成率降低(P<0.05)。4.沉默atg5和atg7可特异性抑制顺铂介导的自噬作用透射电子显微镜观察发现沉默atg5和atg7后应用顺铂组细胞中的自噬体的数量较单用顺铂组细胞明显降低;激光共聚焦显微镜观察发现沉默atg5和atg7后应用顺铂组细胞内自噬体和自噬溶酶体的数量较单用顺铂组细胞中降低。5.沉默atg5和atg7增强耐顺铂睾丸癌细胞I-10/DDP对顺铂的敏感性。MTT结果表明与单用顺铂组相比,沉默atg5和atg7后应用顺铂组的细胞存活率降低(P<0.001,P<0.001);PI单染法结果表明与单用顺铂组相比,沉默atg5和atg7后应用顺铂组的细胞死亡率增加(P<0.01,P<0.001);集落克隆实验的结果表明与单用顺铂组相比,沉默atg5和atg7后应用顺铂组的细胞克隆形成率降低(P<0.01,P<0.01)。结论:1.顺铂可以诱导耐顺铂睾丸癌细胞I-10/DDP发生自噬。2.抑制自噬能增强耐顺铂睾丸癌细胞I-10/DDP对顺铂的敏感性。