背景与目的心血管疾病是临床最常见的慢性病之一,它在世界范围内存在高发病率和高死亡率。心力衰竭是各类心脏病的终末阶段,它的心肌病理改变往往是心肌肥大、凋亡、纤维化并存。当心脏承受压力,发生心脏重塑时典型的病理特征就是心肌肥大,直至发生心力衰竭,而心力衰竭患者的心功能会逐渐恶化。阿霉素(Doxorubicin,DOX)属于蒽环类抗肿瘤药物,是化疗常用药,也常用于建立心肌病动物模型。在临床中,它也是引起充血性心力衰竭的重要病因。这种适用广泛而有效的抗癌药物,由于其心脏毒性及诱发严重心衰的毒副作用,临床使用受到了限制。目前,常见的解决方法是通过阿霉素的减量来减缓心功能的下降,但是不能预防和逆转心力衰竭的发生发展。尽管心力衰竭的致病因素如此确定,但其复杂的生物学机制和潜在的分子机制尚未完全阐明。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是指长度超过200个核苷酸,不编码蛋白质的RNA。大量研究证实,lncRNA在细胞的增殖和分化,以及作为“miRNA海绵”进行染色质修饰中都起着重要的作用。目前,相比于lncRNA在各种癌症发展过程中表达异常的大量报道,其在心脏疾病中发挥作用的研究相对较少。有文献报道,lncRNA肌球蛋白重链相关RNA(myosin heavy chain-associated RNA transcript,MHRT)能通过转录调节核转录因子2-相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor,Nrf2)的表达,阻断阿霉素诱导的心肌细胞凋亡。线粒体的lncRNAuc022bqs.1(LIPCAR)在心肌梗死后早期迅速下降,但在心肌梗死后晚期阶段又上升,可作为心力衰竭患者的一种新型生物标志物。最近一个研究证实,lncRNA心肌肥大相关因子(Myocardial hypertrophy related factors,CHRF)能直接结合微小 RNA-489(microRNA-489,miR-489)从而调控MyD88在肥大心肌中的表达,这提示CHRF在心脏疾病中发挥重要作用。越来越多的证据表明转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族配体水平升高与心力衰竭的进展有关。TGF-β1是一个局部产生的细胞因子,被认为是在各个不同的器官系统中成纤维细胞增值和组织纤维化的主要因素。大量的研究报道证明了 TGF-β1在心力衰竭中的功能性结果,这些结果表明拮抗TGF-β可以抑制纤维化进程并提供有益的心脏效应。最近,CHRF已经被证明能通过miR-489调节MyD88和SMAD3,CHRF的过度表达导致TGF-β1的蛋白表达在二氧化硅所致肺纤维化中增加。缀沙坦(Valsartan,VAL)是一种抗高血压药物,用于治疗有症状的心力衰竭患者,在心力衰竭损伤过程中发挥重要作用。例如,与对照组安慰剂相比,VAL明显延缓了心力衰竭患者生活质量下降的速度。2016年开展了一项心力衰竭模型实验,前瞻性对比脑啡肽抑制剂血管紧张素受体拮抗剂(Angiotensin receptor neprilysin inhibitor,ARNI)和血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)在全球范围内对心力衰竭患者发病率和死亡率的影响,结果显示VAL与ACEI比较,VAL能明显降低由于心力衰竭恶化造成的心源性死亡风险。所以,缬沙坦为治疗心力衰竭提供了有效途径,它在临床实践中被广泛使用,并且因其心肺保护作用而知名。本研究旨在确定CHRF与TGF-β1通路在阿霉素性心力衰竭的心肌组织和细胞中的表达和功能。确定缬沙坦对阿霉素性心力衰竭恶化进程的调节作用,并说明其调节作用的相关机制。方法1.18只8周龄健康雄性C57BL/6小鼠(郑州大学动物中心提供),随机分为3组:对照组(组1,n=6),阿霉素性心衰小鼠组(组2,n=6),和阿霉素性心衰小鼠+VAL治疗组(组3,n=6)。阿霉素性心衰小鼠给予腹腔注射DOX(2.5 mg/kg)共6次,2周内注射完成,以建立心衰小鼠模型;对照组小鼠注射等量的生理盐水;阿霉素性心衰小鼠+VAL治疗组小鼠在模型建立完成后,以VAL(30mg/kg/d)灌胃,治疗时程4周。进行各组小鼠心脏功能检测:左室收缩压(Left ventricular systolic pressure,LVSP)、左室舒张末压(Left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)及左室压力上升及下降的最大速度(±dp/dtmax);用实时定量 PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测小鼠心脏组织内 CHRF 的转录;免疫印迹法(western blot)检测TGF-β1、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(cysteine-containingaspartate-specificproteases-3,Caspase-3)蛋白的表达;比色法检测Caspase-3活性。所有数据均以三次独立实验的平均值±标准差表示。2.分离培养小鼠原代心肌细胞,分为4组:对照组,DOX组,VAL组,DOX+VAL组。DOX组细胞用2μM DOX处理,VAL组细胞用1μM VAL处理,DOX+VAL组细胞使用1μM VAL预处理细胞12h后,2μM DOX处理,并继续在37℃ 5%C02培养箱中培养16h,体外建立HF模型。使用qRT-PCR和western blot分别检测各组小鼠原代心肌细胞中CHRF、TGF-β1的表达,比色法检测Caspase-3活性。TUNEL法检测各组小鼠原代心肌细胞凋亡数。所有数据均以三次独立实验的平均值±标准差表示。3.分离培养小鼠原代心肌细胞,构建si-CHRF及其对照质粒si-control,合成 pcDNA-CHRF。进行原代小鼠心肌细胞 si-control、si-CHRF、及 pcDNA-CHRF转染,转染后原代小鼠心肌细胞用DOX或DOX+VAL处理,体外建立HF模型。并用qRT-PCR和western blot分别检测各组小鼠原代心肌细胞中CHRF和TGF-β1的表达,进行Caspase-3的活性检测,TUNEL法检测小鼠原代心肌细胞凋亡数。所有数据均以三次独立实验的平均值±标准误表示。4.培养HL-1细胞,构建si-CHRF及其对照质粒si-control,合成pcDNA-TGF-β1,转染前1天胰酶消化HL-1细胞并计数,将HL-1细胞分组:si-control,si-CHRF,pcDNA-TGF-β1,si-CHRF + pcDNA-TGF-β1,Western blot检测各组HL-1细胞中TGF-β1、SMAD2、SMAD3及p38蛋白的水平。另一分组:HL-1 细胞分组:pcDNA,pcDNA-CHRF,pcDNA-CHRF+DMSO,pcDNA-CHRF+SB202190(p38 抑制剂,5μM,处理 24h),si-NC,si-SMAD2(即抑制 SMAD2);HL-1 细胞转染 48h 后,经 VAL(1 μM)处理 12 h 后 DOX(2μM)处理;TUNEL检测细胞凋亡程度。所有数据均以三次独立实验的平均值±标准误表示。在western印迹中使用β-肌动蛋白作为对照,并且在qRT-PCR中GAPDH充当对照。5.24只阿霉素性心力衰竭小鼠随机分为4组(n=6每组):control,VAL灌胃,VAL 灌胃+Ad-control 及 VAL 灌胃+Ad-CHRF。腺病毒载体(Ad-control或Ad-CHRF)由上海汉恒生物公司合成,并通过心肌注射至小鼠体内。检测各组小鼠心脏功能:左室收缩压(Left ventricular systolic pressure,LVSP)、左室舒张末压(Left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)及左室压力上升最大速度及左室压力下降最大速度(±dp/dtmax)。结果1.与对照组小鼠相比,阿霉素性HF组小鼠的LVSP降低,LVEDP升高,+dp/dt max降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,阿霉素性HF小鼠心肌组织中CHRF和TGF-β1表达显著增加,caspase-3表达和活化的caspase-3含量显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与阿霉素性HF小鼠比较,阿霉素性心衰小鼠+VAL治疗组小鼠的左心室收缩压(LVSP)升高,左心室舒张末期压(LVEDP)降低,+dp/dtmax升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与阿霉素性HF小鼠比较,阿霉素性心衰小鼠+ VAL治疗组小鼠心肌组织中CHRF和TGF-β1表达显著降低,caspase-3表达和活化的caspase-3含量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)2.与对照组相比,DOX组的CHRF表达显著上调,TGF-β1的蛋白水平升高,且DOX组中的caspase-3表达和活化的caspase-3的含量相对于对照组显著增加(P<0.05)。与DOX组比较,DOX+VAL组CHRF表达显著下调,TGF-β1的蛋白水平降低,且DOX+VAL组中的caspase-3表达和活化的caspase-3的含量显著减少(P<0.05)。3.在用DOX处理的原代心肌细胞中,转染si-CHRF(即抑制CHRF的表达)原代心肌细胞,与si-对照组转染原代心肌细胞比较,CHRF表达被降低,差异有统计学意义(P<0.05);与si-对照组相比,si-CHRF转染的细胞中的TGF-β1蛋白质水平和活化的caspase-3明显降低,si-CHRF转染细胞的凋亡数量也同步减少(P<0.05)。在用DOX+VAL处理的原代心肌细胞中,转染pcDNA-CHRF(即CHRF的过表达)的原代心肌细胞与用pcDNA转染的细胞相比,CHRF表.达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与pcDNA转染的细胞相比,转染pcDNA-CHRF的原代心肌细胞中TGF-β1蛋白质水平和活化的caspase-3明显升高,转染pcDNA-CHRF的原代心肌细胞凋亡数量也同步升高(P<0.05)。4.在用si-CHRF转染的HL-1细胞中,与si-对照相比较,TGF-β1,p-SMAD2,p-SMAD3和p-p38蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。在用pcDNA-TGF-β1转染的HL-1细胞中,与si-对照相转染的HL-1细胞比较,TGF-β1,p-SMAD2,p-SMAD3和p-p38蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。应用 pcDNA-CHRF+SB202190 转染的 HL-1 细胞,与 pcDNA-CHRF+MDSO(control)转染的HL-1细胞相比较,HL-1细胞的凋亡数量明显下降,组间差异有统计学意义(P<0.05)。用pcDNA-CHRF+ si-SMAD2/3转染的HL-1细胞与pcDNA-CHRF+si-NC(control)转染的HL-1细胞相比较,HL-1细胞的凋亡数量明显下降,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结果显示抑制SMAD2/3或p38的表达逆转了由pcDNA-CHRF诱导的细胞凋亡上调。5.与对照组相比,VAL组小鼠LVSP升高,LVEDP降低,+dp/dtmax和-dp/dt max升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与VAL灌胃+Ad-control组比较,VAL 灌胃+Ad-CHRF 组小鼠 LVSP 降低,LVEDP 升高,+dp/dtmax 和-dp/dt max降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.用阿霉素诱导的心力衰竭小鼠模型中,CHRF和TGF-β1表达异常升高,心功能恶化,缬沙坦能逆转这些变化。证实缬沙坦对阿霉素诱导的心力衰竭治疗有效且可能与CHRF和TGF-β1有关。2.在原代小鼠心肌细胞中,DOX诱导心肌细胞凋亡,CHRF和TGF-β1表达异常升高,且都可被缬沙坦逆转。证实缬沙坦、CHRF、TGF-β1和细胞凋亡共同参与心力衰竭发展。3.使用si-CHRF、pcDNA-CHRF转染原代心肌细胞,测定TGF-β1和caspase-3活性,证实CHRF影响了 TGF-β1的表达和原代心肌细胞凋亡。4.用 si-CHRF 和 pcDNA-TGF-β1转染或共转染 HL-1 细胞,Western blot 检测 TGF-β1,p-SMAD2,p-SMAD3 和 p-p38 蛋白表达。用 pcDNA,pcDNA-CHRF,pcDNA-CHRF + si-NC(si-阴性对照)或 DMSO,pcDNA-CHRF + si-SMAD2/3或SB202190(p38抑制剂,5μM,24小时)转染HL-1细胞,然后用1μM的VAL处理细胞12小时,然后是2μM的DOX处理细胞。证实CHRF通过TGF-β1/Smads和TGF-β1/p38途径调节TGF-β1及其靶基因的表达。5.小鼠心肌注射Ad-CHRF后发现,缬沙坦改善的恶化的心功能被逆转,CHRF的过度表达逆转了缬沙坦的心脏保护作用,证实缬沙坦是通过CHRF调节TGF-β/Smads和TGF-β/p38途径来改善DOX诱导的心力衰竭。6.本研究首次证实缬沙坦是通过CHRF调节TGF-β/Smads和TGF-β/p38途径来改善DOX诱导的心力衰竭;本研究首次证实心力衰竭,缬沙坦,CHRF和TGF-β1通路之间的显著相关性。