猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高致病力、高死亡率的接触性传染病。该病在我国一直流行,且以地区散发性为主;尽管各大养殖场对CSF给予极大的关注,但由于不科学的免疫程序、参差不齐的疫苗质量及猪群不规范的饲养条件等,致使当前CSF仍然严重威胁着我国的养猪业。E0、E1及E2是CSFV的三个囊膜糖蛋白,其中E2是病毒最主要的抗原蛋白,同时E2也在CSFV与宿主细胞的相互识别及吸附过程中起重要介导作用;因此,E2蛋白的深入研究,对于探讨CSF的感染机制及新型疫苗的设计都具有重要意义。计算机辅助多肽设计技术的飞速发展,尤其是虚拟分子对接技术的广泛应用,为多肽筛选提供了高效的技术途径,也使得配体与受体之间相互作用的研究更加深入。基于分子对接技术的多肽虚拟筛选,不仅操作简单快捷、降低多肽筛选的强度及缩短研发周期,还大大地提升了筛选成功率。本研究借助虚拟分子对接技术,设计多条靶向CSFVE2蛋白的亲和肽,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)及等离子体共振试验(SPR)鉴定其亲和性,之后通过体外抑制试验评价其抗CSFV感染的活性,为深入研究E2在病毒感染中的作用提供新思路;并通过多肽与磁珠偶联,初步建立快速纯化水稻表达E2蛋白的方法,为新型高效疫苗的研发提供可靠的技术支持。1猪瘟病毒E2蛋白亲和肽的理性设计随着越来越多蛋白质晶体结构被解析,基于结构模型的计算机辅助多肽设计技术也呈现快速的发展。本研究借助分子模拟对接及虚拟筛选技术,组建一系列不同长度的随机多肽组合库,将库中的多肽与同源建模的CSFV E2蛋白上特定的位点实施分子对接,并通过MOLCAD模块分析复合物的相互作用力,最后利用软件评分系统对对接结果进行综合评定与分析,设计出一系列靶向CSFV E2的亲和性多肽,以期为后续的抗CSFV感染、新型疫苗设计等研究提供帮助。2猪瘟病毒E2蛋白亲和肽的筛选及鉴定首先,本研究通过ELISA及SPR试验鉴定人工合成的多肽序列与CSFVE2蛋白相互作用的亲和性及特异性;结果显示57条多肽中有18条与E2存在不同程度的亲和性结合,其中P86、P88、P708、P704、P92、P90与E2具有较高亲和力,平衡解离常数(KD)值分别为 1.49nM、3.88nM、4.72nM、4.84nM、49.4nM 及 50.8nM,表明借助分子对接技术设计的靶向E2亲和肽是可行的,并为后期试验研究提供可靠的试验数据及材料。其次,将两种不同策略GalaxyPepDock及FlexX/SYBYL给出的多肽序列评分值与其KD值的相关性进行分析,以期验证全局搜索及局部搜索策略在蛋白与多肽配基对接中的重要性;结果显示,FlexX/SYBYL预测的Cscore值与多肽KD值之间的Kendall和Spearman相关系数分别为-0.637及-0.767,呈中等程度的相关性,表明实施分子对接时采用局部搜索且充分考虑多肽的柔性要优于全局搜索的对接策略。本试验数据为今后多肽配基的分子设计提供合理的参考,也为蛋白质功能解析提供有效的指导。3猪瘟病毒E2蛋白亲和肽的抗病毒活性研究阻止病毒侵染宿主细胞是研究抗病毒感染的重要方式之一。本研究在前一章筛选到6条靶向CSFV E2高亲和肽的基础上,通过体外抑制试验进一步评价其抗CSFV感染的活性;病毒与多肽孵育后接种PK-15细胞,结果显示6条多肽在一定程度上均能抑制CSFV感染,其中P88、P86及P708的抑制率高达80%以上,抑制活性最好;同时,多肽封闭细胞后接种病毒,结果显示6条多肽抗CSFV感染的活性较差,表明靶向E2的亲和肽不能通过封闭受体而阻止CSFV入胞,进一步证实亲和肽的抗病毒靶点在病毒表面而不是细胞膜上。本试验结果可为进一步研究病毒受体及抗病毒药物设计提供线索及理论依据。4亲和肽在猪瘟新型疫苗前期研究中的应用作为CSFV的免疫优势蛋白,E2 一直是CSFV新型亚单位疫苗研制的重点。本研究在前期借助分子对接技术筛选到靶向E2亲和肽的基础上,将其固定在磁珠上,成功从粗提水稻蛋白中纯化到有效的E2蛋白,初步建立了快速纯化水稻表达E2蛋白的方法;小鼠免疫抗体评价显示,免疫剂量为l0μg和25μg的纯化E2蛋白组,在接种后第14天抗体就达到阳性水平,且随接种时间推移,呈逐渐增长的趋势,到接种后第42天抗体阻断率可高达86.18%和90.68%,刺激机体产生的免疫保护反应远远优于对照组,表明靶向E2的亲和肽纯化水稻表达E2蛋白是高效、可靠的。这种新的多肽设计方法为新型疫苗的设计及研发提供有力的技术支持也为蛋白多肽配基的筛选提供更为广阔的平台。