目的:骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是世界范围内最为常见的骨关节疾患,不仅对患病者个人及家庭造成了很大的影响,对于卫生保健体系和社会经济也带来了沉重的负担。随着全球人口老龄化程度的增加、肥胖人群的增多和关节损伤患者数量的增长,OA的发病变得更加普遍,据估计目前全球约有2.5亿人受到骨关节炎的影响。但在如此沉重的负担下,大部分骨关节炎患者并未得到适当的治疗。骨关节炎是一种复杂的慢性疾病,涉及到关节的多种组织。目前骨关节炎的治疗方法虽然有许多种,但是大都是姑息性和对症的治疗。在OA众多的危险因素之中,衰老是最为关键的因素之一。靶向关节内组织的衰老性改变可能是OA有希望的治疗手段。人类寿命的增长使医疗卫生服务机构面临着逐渐增多的患有衰老相关疾病的患者。例如神经退行性疾病如阿尔茨海默病,心肌肥大,骨质疏松等等。大量的研究表明这些疾病与受累组织中长时间的衰老细胞累积密切相关。OA也是衰老相关的主要疾病之一,是伴随着磨损、炎症和衰老等病理过程的复合性关节疾病。OA关节软骨中衰老细胞的积累由Price等于2002年首次提出,目前是OA领域研究的热点。细胞衰老是衰老和衰老相关疾病的主要推动因素这一观点已经被广泛地接受。软骨细胞的衰程过程与大部分细胞衰老的病理过程相类似。细胞衰老会由应激因素所诱发,包括基因毒性药物、营养的剥夺、线粒体功能障碍和致癌基因的激活等等。衰老细胞会发生不可逆的生长阻滞,但是它们并未丧失代谢活性并可分泌多种具有生物活性的分子——被称为“衰老相关的分泌表型（senescence-associated secretory phenotype）”,简称为SASP。研究表明SASP在创面愈合及刺激周围临近细胞生长等方面起到有益作用。但是随着衰老程度的增加,积累的衰老细胞会持续分泌SASP导致慢性的炎症状态（“inflammaging”）,这推动了许多衰老的标志性病理改变的发生。抑制SASP的治疗是目前抗衰老的重要治疗策略之一,而在调节SASP分泌的诸多信号通路之中,NF-κB信号通路发挥的作用是最为关键的。因此寻求通过调节NF-κB信号通路来抑制SASP这一衰老的推动因素,进而发挥抗衰老的治疗作用可能是合理的治疗方法。目前应用于OA治疗领域的自然提取物有许多种,因为自然提取物本身具有药物毒副作用低,耐受性好等诸多优点,这些药物展现了令人满意的治疗效果。紫檀芪（Pterostilbene,PTE）为反式二苯乙烯类化合物,由于最初在紫檀中发现,故而命名为紫檀芪。研究结果显示,紫檀芪具有抗肿瘤、保护心血管、抗氧化、抗炎及抗衰老等多种药理学活性,而且具有副作用小,生物利用度高等诸多优点,是当前研究的热点化合物之一,但近年来在OA的治疗领域的相关研究较少。本研究设想:1.关节不稳定诱导的OA模型会不会使大鼠膝关节的衰老程度增加?进而进一步加速OA的病情进展?2.因为NF-κB信号通路在衰老的病理调控中起到重要作用,紫檀芪能否通过调节NF-κB信号通路进而调节SASP来抑制软骨细胞衰老,进而起到OA的治疗作用呢?本研究目的是:1.通过体内动物实验及体外的细胞实验,探究紫檀芪对关节软骨细胞衰老和骨关节炎的治疗作用。2.探究NF-κB及其上下游通路在PTE发挥上述治疗效果中所发挥的作用。研究方法:1.目前软骨细胞衰老在OA中是研究的热点,抑制软骨细胞衰老被认为是有希望治疗OA的方法,其中通过药物降低衰老相关表型（SASP）的表达是抑制衰老的两种主要治疗手段之一。本研究同时选择OA中最主要的SASP（IL-6及MMP-13）作为研究指标。查阅文献,NF-κB信号通路是细胞衰老相关表型（SASP）的主要调节通路,本研究选择紫檀芪（PTE）作为作用药物研究其是否能够通过抑制PI3K/AKT/NF-κB/SASP信号通路来起到抗软骨细胞衰老,进而治疗OA的作用。2.检验PTE对大鼠骨性关节炎OA模型的影响。大鼠膝关节OA模型采用切断膝关节前交叉韧带和内侧半月板胫骨韧带（ACLT+DMM）的方式造模,分为CG（sham）组、ACL+DMM OA组、OA+PTE组三组。造模一周后起OA+PTE腹腔注射紫檀芪（20mg/kg）,每2天注射一次。6周后处死大鼠,观察大鼠膝关节大体外观表现。留取膝关节灌洗液测定IL-6水平。随后取下膝关节4%多聚甲醛中固定48h后EDTA脱钙,并制作厚度为5μm的石蜡组织切片。对大鼠膝关节关节软骨切片进行HE、甲苯胺蓝及番红-固绿染色,采用Mankin和OARSI组织学评分标准对各组大鼠膝关节软骨切片进行病理学评分。我们同时还进行了免疫组化实验来检测各组大鼠关节软骨中II型胶原、MMP-13、IL-6、p16、p21的表达。3.在体外细胞实验中检测PTE对IL-1β作用下大鼠软骨细胞的衰老程度的影响。我们首先提取了大鼠原代软骨细胞,行免疫荧光鉴定。加入不同浓度PTE,MTS方法检测进行大鼠原代细胞毒性和细胞活力测定,确定紫檀芪的工作浓度。加入10ng/ml的IL-1β模拟OA炎症构建细胞衰老模型,并用不同浓度的PTE处理软骨细胞。检测衰老相关-β-半乳糖苷酶比较各组中衰老细胞比例（SA-β-Gal染色阳性细胞比例）、细胞周期及ROS水平。PCR检测各组Ⅱ型胶原、MMP-13、IL-6、p16、p21 m RNA表达。Western blot检测Ⅱ型胶原、ADAMTS-5、MMP-13、IL-6、p16、p21蛋白表达。4.通过生信分析证明NF-κB信号通路在OA的病理过程及衰老过程中起重要的作用,并同时筛选出了与OA病情密切相关的NF-κB上游通路—PI3K/AKT信号通路。验证PTE是否能够通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路发挥作用,抑制SASP分泌,从而发挥抗炎抗软骨细胞衰老的作用。分为空白对照组,IL-1β组,IL-1β+PTE（10μmol/L）,IL-1β+PTE（20μmol/L）四组。Western blot检验PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、p65、p-p65。免疫荧光检测各组软骨细胞NF-κB p65核易位情况。使用分子对接技术验证PTE与PI3K蛋白之间的相互作用关系。结果:1.对各组大鼠膝关节行X光片检查,同时行软骨石蜡切片HE染色、甲苯胺蓝染色及番红-固绿染色观察各组大鼠膝关节软骨病理变化,使用Mankin评分和OARSI评分对关节软骨进行OA病理学评分。通过各组之间的比较,我们发现各组大鼠膝关节X光片放射学评分并无显著差异,而病理学研究显示ACLT+DMM的OA模型6周后大鼠膝关节呈现中早期OA的表现,而OA+PTE治疗组和OA组Mankin评分和OARSI评分的显著差异显示PTE对于OA有治疗作用。2.通过ELISA检测大鼠膝关节灌洗液中IL-6的浓度,我们发现ACLT+DMM手术造模的OA大鼠膝关节,OA大鼠的关节灌洗液中IL-6的水平较对照组大鼠显著升高。而经过PTE治疗的OA大鼠膝关节灌洗液中IL-6的水平较未用药治疗的OA大鼠显著降低,差异具有统计学意义。3.大鼠软骨切片免疫组化染色结果显示,与OA组大鼠相比,PTE治疗组大鼠关节软骨中Ⅱ型胶原的表达显著增加,MMP-13、IL-6的表达显著降低。同时各组大鼠膝关节软骨p16和p21免疫组化染色结果显示OA组大鼠衰老标志物p16和p21表达明显较对照假手术组大鼠增多,差异具有统计学意义,而经过PTE治疗的大鼠与OA组大鼠相比,软骨细胞中的p16、p21表达显著降低,且具有的统计学意义。同时相关性分析表明,p16和p21的阳性细胞率与Mankin评分和OARSI评分具有相关性。4.对提取的大鼠原代软骨细胞进行Ⅱ型胶原的免疫荧光染色鉴定后,进行MTS检测确定PTE的适宜作用浓度（10μmol/L和20μmol/L）。进行衰老细胞的SA-β-Gal染色,IL-1β显著增加了SA-β-Gal阳性表达的大鼠软骨细胞数量,证明IL-1β能够增加软骨细胞的衰老程度,PTE治疗后,治疗组SA-β-Gal的阳性软骨细胞比率降低,具有统计学意义,说明PTE具有抗IL-1β诱导的软骨细胞衰老作用。IL-1β使软骨细胞G0-G1期细胞比例显著增加,发生细胞周期停滞,而PTE治疗组G0-G1期软骨细胞显著降低。IL-1β使软骨软骨细胞ROS水平显著升高,而PTE显著降低了炎性造模的大鼠软骨细胞的ROS水平。使用PCR及Western blot技术检测PTE对IL-1β作用下的软骨细胞中骨关节炎相关指标的表达情况。我们发现IL-1β能够显著增加ADAMTS-5和MMP-13的基因和蛋白表达,并降低Ⅱ型胶原的表达。与此同时IL-1β显著增加了IL-6,p16,p21的表达。IL-1β的作用被PTE所抑制。20μmol/L的PTE能够显著抑制MMP-13、IL-6、ADAMTS-5、p16、p21的表达,显著提高Ⅱ型胶原的表达。5.Western blot检测显示IL-1β显著激活了PI3K/AKT及NF-κB信号通路,pPI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-p65/p65的比率以及p-IκBα表达较对照组显著增加,而10μmol/L和20μmol/L的PTE能够显著抑制PI3K/AKT及NF-κB信号通路的激活程度。同时p65的免疫荧光染色显示IL-1β的促炎作用下,p65发生核内移,而PTE治疗组的p65则外移至胞质,提示PTE发挥了抗炎作用。6.分子对接实验结果显示,PTE能够与PI3K蛋白的GLU-628、ASP-584、ARG-389三个位点相互作用PTE可以通过与PI3K蛋白的三个氨基酸残基位点（GLU-628、ASP-584、ARG-389）相互作用,并稳定附着在PI3K抑制结合口袋上,且亲和力较高。也就是说PTE占据了结合位点,从而发挥抑制PI3K的磷酸化的作用。结论:1.体内实验证明衰老的标记物与OA的严重程度相关联,紫檀芪（PTE）能够降低OA炎性及衰老标志物表达水平,降低大鼠膝关节OA的严重程度。2.体外细胞实验中PTE也能够降低IL-β诱导的炎性OA模型软骨细胞的衰老程度。3.PTE通过抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路,降低SASP的表达发挥抗软骨细胞衰老从而治疗OA的作用。