[背景]人类肠道病毒(HEV)隶属于小核糖核酸(Ribonucleic Acid, RNA)病毒目(Picornavirales)小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus),基因组为单股正链RNA。病毒基因组的5’非编码区含有基因组RNA复制和翻译所需的结构,3’非编码区具有与基因组复制有关的高度保守的二级机构及多聚腺苷酸(polyA)尾。编码区分为结构蛋白编码区(P1)和非结构蛋白编码区(P2和P3)。结构蛋白编码区(P1)依次编码VP4、VP2、VP3和VP1共4个衣壳结构蛋白。其中VPl蛋白位于病毒颗粒最外侧,含有主要的抗原位点,是进行基因分型和分子流行病学研究最主要的靶基因。根据VP1序列核苷酸差异,HEV分为HEV A组(HEV-A)、B组(HEV-B)、C组(HEV-C)和D组(HEV-D)4个组。目前,HEV-B包含59个血清型,为4个组中所含血清型最多的一组。HEV-B病毒不仅血清型别众多,而且流行范围广泛,可导致多种疾病的暴发流行,加之HEV基因组变异迅速,新的血清型不断出现,因而HEV-B血清型病毒成为当前研究关注的热点之一。早在50多年前,人们就发现RNA病毒间复杂的基因变异。近些年的研究发现,在全球多个脊髓灰质炎(以下简称脊灰)病毒(PV)减毒活疫苗免疫覆盖率低的地区,多次出现由重组后的脊灰疫苗衍生株病毒循环(cVDPVs)导致的脊灰暴发,使消灭脊灰的免疫策略及疾病监测变得更为复杂,也引起人们对HEV遗传变异机制的研究产生了新的兴趣,更加关注HEV基因组的易变性,为研究HEV的进化提供了新的视点。HEV基因组的进化方式包括核苷酸点突变和遗传重组。P1编码区的进化几乎均由核苷酸替换所引起的点突变驱动的。P2和P3区编码病毒复制所需的非结构蛋白和酶,这些多肽蛋白序列的相对保守,功能相对稳定,而大多数点突变对于蛋白和酶的功能来说是不利的,基因重组成为其进化的主要手段。HEV的进化就是基因组的各个部分在以不同方式进化的同时,通过遗传重组而产生出的被自然选择的优势毒株的过程。由于3D编码区位于基因组的3’末端,故比较VP1和3D基因在系统发生上的差异,可作为筛选重组发生的指标。在过去20多年里,山东省从急性弛缓性麻痹(AFP)、无菌性脑膜炎(AM)2种疾病监测病例分离到上千株HEV山东株,其中多数属于HEV-B,且有些HEV-B血清型呈现为优势血清型。HEV感染已成为严重威胁广大人群特别是儿童身体健康与生命安全的重大公共卫生问题之一。因此,运用分子流行病学的方法,通过对HEV-B优势血清型山东株基因序列的分析,探索HEV-B在区域性引入和扩散过程中VP1进化遗传学和居群动力学特征,分析不同血清型间重组在HEV进化中的发生频率,对于HEV所致相关疾病的机制及其预防控制均具有重要的理论和实际意义。[研究目的]1.构建并完善HEV-B山东株优势血清型(CVA9、CVB3、CVB5、Echo6、 Echo7、Echo11、Echo14、Echo19、Echo25、Echo30)的VP1区和3D区基因数据库,并对其进行基因特征研究。2.探讨HEV-B山东株优势血清型基因重组的发生,阐明各主要血清型在山东省共循环过程中的基因重组规律及重组基因片段的转移方向和频率。3.分析HEV-B山东株优势血清型的基因序列起源、进化速度及流行史重构等进化起源特征。[研究方法]1.毒株来源：本研究所选毒株来自山东省1989-2010年AFP和AM2种疾病监测病例。实验前接种RD或Hep-2细胞进行病毒增殖。2.基因测序：提取病毒RNA,RT-PCR扩增VP1和3D区基因片段,经1%琼脂糖凝胶电泳后对阳性产物进行序列测定。3.型别鉴定：将各血清型的VP1序列通过NCBI在线提供的BLAST程序与数据库序列进行比对,确定HEV山东株的血清型别。4.生物信息学分析：使用Mega4.0软件,构建VP1区和3D区系统进化树,分析HEV山东株优势血清型基因重组情况。通过BEAST1.6.2软件分析HEV-B山东株优势血清型的进化遗传学特征,重构优势血清型毒株在山东省内的流行史。[主要结果]1. HEV-B山东株优势血清型的确定：在前期研究中,已通过HEV分子生物学定型方法对部分山东株的血清型别进行鉴定。本研究在前期研究基础上继续对1989～2010年分离自山东省AFP和AM监测病例的HEV山东株进行型别鉴定,共鉴别出非脊灰肠道病毒(NPEV)1010株,涵盖58个HEV血清型别。其中,CVA9、CVB3、CVB5、Echo6、Echo7、Echo11、Echo14、Echo19、Echo25、Echo30这10个血清型在山东省历年HEV检测中共分离到792株,占所有已定血清型分离株的78.4%(792/1010),为HEV-B山东株优势血清型别。2.HEV-B山东株优势血清型基因重组分析：本研究共选取458株HEV-B山东株3D序列进行序列分析。通过构建3D区系统进化树发现,山东省10个优势血清型毒株间在非结构蛋白编码区内存在频繁的基因重组现象,山东株在3D区系统进化树中共划分为13个主要的基因簇。(1)3D区系统进化树显示,每个基因簇所包含血清型别不尽相同,同一血清型的山东株在3D区系统进化树中分处不同的基因簇。每个基因簇的山东分离株归属于2-9个HEV血清型,第1、4、6、8、12、13基因簇为优势基因簇。(2)3D编码区不同基因簇的主要分离时间不完全相同。3D区系统进化树基因簇的最长分离时间跨度为21年,各基因簇平均优势分离时间跨度约为15(14.8+4.6)年。3. HEV-B山东株优势血清型进化起源分析：本研究所选10个HEV-B山东优势血清型毒株的祖先约起源于1885～1913年之间,不同血清型VP1区核苷酸序列每年每个碱基位点的进化速度为1.007×10-3～9.856×10-3。其中,CVA9、Echo6、 Echo7、Echo25血清型山东株与来自中国其他省份和世界各地的分离株存在共同的进化祖先,而CVB3、Echo11、Echo14、Echo19、Echo30血清型山东株仅与中国其他省份的相应毒株有共同的祖先起源。[主要结论]1.CVA9、CVB3、CVB5、Echoo6、Echo7、Echo11、Echo14、Echo19、Echo25、Echo30血清型为山东省HEV-B优势血清型。在长达22年的AFP和AM疾病监测中,本研究所选10个血清型毒株在山东省历年分离数明显高于其他HEV血清型别,并且在山东省局部地区曾多次引起AM等相关疾病的暴发流行,为山东省内共循环毒株的HEV-B优势血清型。2.基因重组是HEV非结构蛋白区重要的进化方式。HEV-B山东株在3D进化树中划分为13个主要的基因簇,各基因簇中HEV-B血清型种类和数量不同。同一血清型山东株位于多个基因簇,而不同基因簇的主要分离时间不完全相同。提示HEV-B山东株非结构蛋白区基因片段转移频繁,存在活跃的基因重组。3. HEV-B山东株优势血清型VP1区核苷酸变异活跃,在山东省内存在多个传播链的共同流行。重构VP1区流行史发现,HEV-B山东株优势血清型的共同祖先起源于97年前,同一血清型的不同传播链在不同的时期进化速度不一致,提示HEV山东株在人群中的进化不符合匀速增长模型和严格分子钟进化方式。