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随着人工授精技术在牛产业的广泛应用,种公牛对奶牛群体的遗传贡献高达70%以上,使得精液品质的质量与牛场经济效益直接相关。正常获能对于精子的受精能力极为重要,该过程由多个具有细胞时空特异性的基因协同表达共同完成。因此研究与精子活力相关基因的表达和分子调控机理对于阐明精子发生的机理至关重要。全基因组关联分析发现,CAPN1(calpain1)基因与动物精子活力相关。本实验通过研究CAPN1基因在中国荷斯坦公牛睾丸组织和精子中的表达,启动子区SNPs的鉴定及功能性分析,以增加对CAPN1基因与公牛精液品质的相关性及其表达调控机理的了解,增加了对公牛高繁殖性状形成的分子机理的认识。 1.中国荷斯坦公牛CAPN1基因的表达与定位 CAPN1基因在精子发生过程中发挥着重要作用。首先采用RT-qPCR方法测定了CAPN1基因在刚出生公牛和成年公牛睾丸及精子中的表达量。结果显示:CAPN1在刚出生公牛和成年公牛的睾丸及精子中均有表达,且表达存在组织差异性。CAPN1在精子中的表达量最高,且在成年公牛睾丸中的表达量高于刚出生公牛睾丸的表达量。然后利用Western blot技术检测,发现CAPN1蛋白在成年公牛睾丸、附睾组织及精子中均有表达,CAPN1蛋白在精子中的表达量最高,在不同组织中其表达量也存在差异。Western blot的结果与mRAN水平检测结果相一致。进一步利用IHC(immunohistochemical)技术揭示了CAPN1蛋白主要在生精上皮(该位置包含精母细胞、初级精母细胞和精细胞)处表达。最后利用IF(immunofluorescence)技术发现CAPN1蛋白表达于公牛精子头部。上述系列实验结果表明CAPN1蛋白可能与精子获能相关。 2.CAPN1基因启动子活性分析与功能性SNPs的鉴定 首先利用在线预测软件对牛CAPN1基因的5’侧翼区序列进行生物信息学分析,然后分别构建P1(g.-1638~g.-769)、P2(g.-1306~g.-769)和P3(g.-1012~g.-769)3个启动子缺失片段重组pGL3载体,并利用双荧光素酶报告基因检测系统分析了牛CAPN1基因5’侧翼区的启动子活性。将构建的含有不同长度启动子区片段的pGL3-Basic荧光素报告载体分别瞬时转染MLTC细胞,根据荧光素酶活性的强弱初步确定5’端侧翼区g.-1306~g.-1012位点为CAPN1基因核心启动子区。测序发现在CAPN1核心启动子区域存在一个SNP g.-1256 A>C,进一步将含有突变型和野生型的启动子片段分别构建入pGL3-Basic荧光素报告载体,分别转染细胞后发现突变型启动子活性显著高于野生型(P<0.05)。经群体基因分型和关联分析发现,g.-1256 A>C的3种基因型对精子活力具有显著影响,其中CC基因型个体的精子活力显著高于AA基因型个体(P<0.01)。 3.启动子区SNP g.-1256 A>C影响精子活力的分子机制 CAPN1核心启动子区域的SNP g.-1256 A>C能够增强启动子的活性,且突变后精子活力显著提高。为了探究SNP g.-1256 A>C影响精子活力的分子机制,我们通过RT-qPCR试验检测了不同基因型个体中CAPN1 mRNA的表达量,结果发现CAPN1 mRNA在CC基因型个体中的表达量显著高于AA基因型个体中的表达量;同时我们运用Western blot技术进一步检测了不同基因型个体精子中CAPN1蛋白的表达量,结果发现CC基因型精子中CAPN1蛋白表达量较高,这一结果与RT-qPCR定量结果相符。因此我们推测g.-1256 A>C是通过影响CAPN1基因启动子区活性,进而影响CAPN1基因在精子中的表达,最终改变了公牛精子的活力。因而启动子区SNPg.-1256 A>C可作为精子活力的分子标记用于种公牛的早期选育中。