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近年来,越来越多的研究发现非编码RNA及其竞争性内源RNA （ceRNA）互作网络在调控哺乳动物的繁殖生理过程中发挥着至关重要的作用,包括了卵母细胞的生长、卵泡细胞的增殖、分化以及凋亡、类固醇的合成和分泌以及成熟卵泡排卵和闭锁等过程。然而,蛋鸡的繁殖机制与哺乳动物不同,成熟卵巢中包含了许多大小不等的卵泡以维持持续排卵,涉及了卵泡募集、选择、优势化以及排卵等一系列动态循环过程,直接影响蛋鸡的产蛋性能。目前研究发现,涉及蛋鸡繁殖调控的内源和外源因子很多,但非编码RNA及其调控网络在蛋鸡繁殖机理上的研究仍相对滞后。因此,本试验通过对蛋鸡不同生理时期（15W、20W、30W以及68W）卵巢组织进行全转录组测序,深入挖掘潜在的circRNA-miRNA-mRNA关联的ceRNA调控网络,以研究其对蛋鸡卵泡颗粒细胞发育和类固醇合成及其相关信号通路的影响,为完善非编码RNA在蛋鸡的繁殖调控机制提供理论参考。相关结果如下:试验一基于转录组学筛选与卵泡类固醇激素合成相关的潜在ceRNA（circRNA-miRNA-mRNA）网络采集蛋鸡不同生理时期（15W、20W、30W以及68W）卵巢组织进行全转录组测序,利用生物信息学分析和卵泡颗粒细胞离体试验对目标ceRNA网络进行挖掘和筛选。结果表明,在转录组数据中共鉴定出差异表达的mRNA 1090个、miRNA209个和circRNA 403个。通过DE circRNA-miRNA-mRNA关联性分析以及功能富集分析发现ceRNA网络在蛋鸡卵巢组织发育、生物代谢、氨基酸的生物合成、血管生成以及类固醇合成等功能上发挥着重要的调控作用。gga-miR-449 家族中 gga-miR-449a、gga-miR-449b-5p 以及 gga-miR-449c-5p 具有同一种子序列,且靶向多个与类固醇合成相关的潜在基因。经细胞试验验证和RNA hybird预测,我们初步筛选得到了它们共有的潜在靶基因IGF2BP3和circRNA-novelcirc001840。同时,不同卵泡颗粒层和膜层表达谱发现,gga-miR-449a、gga-miR-449b-5p和gga-miR-449c-5p在颗粒层中高度表达,而IGF2BP3则主要在膜层表达,其表达趋势与miRNAs相反;此外,novelcirc0010840在颗粒层中的表达量高于膜层中的表达量。综合上述结果,我们初步构建了 3 个潜在 ceRNA 网络,即:novelcirc0010840/gga-miR-449a/IGF2BP3、novelcirc0010840/gga-miR-449b-5p/IGF2BP3 以及 novelcirc0010840/gga-miR-449c-5p/IGF2BP3,作为后续卵巢调控功能研究的依据。试验二circEML1对卵泡颗粒细胞增殖和类固醇激素合成的调控作用利用PCR扩增、RNAase R处理、核质分离以及细胞试验等方法对circEML1的环状结构、分布以及功能进行分析和鉴定。结果表明,circEML1 （novel circ0010840）为棘皮动物微管相关蛋白（EMAP）样1 （EML1）的第二、三以及四外显子的反向剪接而成的环状RNA,且在细胞质中高表达。由细胞功能鉴定可知,过表达circEML1对蛋鸡卵巢颗粒细胞的活力和增殖无显著性影响,但能显著促进细胞增殖基因CCND1和CCND2的表达,抑制CDK2的表达（p＜0.01）。同时,过表达circEML1能够显著促进颗粒细胞中类固醇合成基因CYP19A1和StAR的表达,以及促进E2/P4激素的释放（p＜0.05或p＜0.01）,表明circEML1在颗粒细胞类固醇的合成和分泌中具有重要的调控作用。通过靶向关系验证可知,circEML1能够充当gga-miR-449a的分子海绵,在细胞质中抑制gga-miR-449a的表达,并促进潜在的下游靶基因IGF2BP3的mRNA和蛋白表达。试验三gga-miR-449a对卵泡颗粒细胞增殖和类固醇激素合成的调控作用利用CCK8、qRT-PCR、EdU、流式细胞术、ELISA以及双荧光素酶报告等方法鉴定gga-miR-449a对蛋鸡卵泡颗粒细胞增殖以及类固醇激素合成的影响以及与IGF2BP3的靶标关系。结果表明,与对照组相比,过表达gga-miR-449a对颗粒细胞的增殖无明显变化,但能显著上调细胞增殖基因CDK2和CKD6的表达,降低CCND1的表达（p＜0.05或p＜0.01）;这与过表达circEML1的结果大致相反。此外,过表达gga-miR-449a能够显著抑制颗粒细胞中类固醇合成基因CYP19A1和StAR的表达,并抑制E2和P4的分泌（p＜0.05或p＜0.01）;而干扰gga-miR-449a则显著促进了CYP19A1和StAR的表达以及E2/P4的释放（p＜0.05或p＜0.01）,且与过表达circEML1的结果相一致,暗示了circEML1可以通过海绵吸附gga-miR-449a而发挥颗粒细胞中类固醇合成和分泌的调控作用。同时,由靶标关系验证可知,gga-miR-449a能够降低IGF2BP3的mRNA和蛋白的表达,并通过靶向IG2BP3的3’UTR降低荧光素酶活性（p＜0.01）,这进一步完善了该ceRNA网络的作用机制,即circEML1可以通过竞争性结合gga-miR-449a,而解除gga-miR-449a对IGF2BP3的抑制作用。试验四IGF2BP3及其潜在信号通路对卵泡颗粒细胞增殖和类固醇激素合成的调控作用通过构建IGF2BP3的过表达载体和干扰片段,利用CCK8、qRT-PCR、EdU、流式细胞术以及ELISA等技术鉴定IGF2BP3及其潜在信号通路对颗粒细胞的增殖和类固醇激素合成的影响。结果表明,IGF2BP3对卵巢颗粒细胞的增殖无显著性影响,但能显著促进细胞增殖基因CCND1和CCND2的表达,同时抑制CDK2和CKD6的表达（p＜0.05或p＜0.01）,这与过表达circEML1和干扰gga-miR-449a的结果相似。此外,IGF2BP3能够显著上调颗粒细胞中CYP19A1和StAR的表达,并显著促进E2和P4的释放（p＜0.05或p＜0.01）,这也与过表达circEML1和干扰gga-miR-449a的结果相一致,表明circEML1可以通过海绵吸附gga-miR-449a而调节IGF2BP3的表达,进而促进蛋鸡颗粒细胞类固醇的合成和分泌。同时,通过与信号通路抑制剂共处理,研究了 IGF2BP3发挥效应的AKT、PI3K、mTOR、p38MAPK以及IGF等5个潜在信号通路,发现IGF2BP3很可能通过mTOR和p38MAPK信号通路调控类固醇激素合成和分泌的作用。试验五回补试验—验证ceRNA网络对蛋鸡颗粒细胞类固醇激素合成和分泌的调控作用在卵泡颗粒细胞中,通过共转染过表达circRML1和NC mimic或gga-miR-449amimic,利用qRT-PCR、WB以及ELISA等方法鉴定circEML1和gga-miR-449a的互作对靶基因和类固醇激素合成的影响。结果表明,gga-miR-449a mimic能够逆转过表达circEML1对gga-miR-449a表达的抑制,以及下游靶基因IGF2BP3 mRNA和蛋白表达的促进作用;同时,也能显著消除过表达circEML1对类固醇合成基因CYP19A1和StAR基因表达以及E2/P4分泌的促进作用（p＜0.05或p＜0.01）。这些结果再次验证了 circEML1/gga-miR-449a/IGF2BP3组成的ceRNA网络的作用机制以及对蛋鸡颗粒细胞类固醇激素合成和分泌的调控作用。综上可知,circEML1/gga-miR-449a/IGF2BP3互作网络对蛋鸡卵巢功能具有重要的调控作用,即circEML1通过海绵吸附gga-miR-449a调节下游靶基因IGF2BP3的表达,进而调控蛋鸡卵巢颗粒细胞类固醇激素E2/P4合成和分泌;且mTOR/p38MAPK信号通路在此调控中扮演关键角色。