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目的:长期不进展者(long term non-progressors，LTNPs)自发控制病毒感染的机制是诱导功能性治愈和进行有效防治干预的重要依据。然而目前机制尚未完全阐明。本研究试图通过对LTNPs病毒学和免疫学特征分析，探讨病毒控制的可能影响因素，并以其为主要供体，分选抗HIV-1广谱中和抗体(broadly neutralizing antibodies，bNAbs)，为AIDS的预防和治疗提供新的思路。
方法:(1)根据血浆病毒载量的动态变化，将LTNPs分为病毒学控制组(viremic control，VC-LTNPs)和病毒学进展组(non-VC-LTNPs)。检测VC-LTNPs和non-VC-LTNPs的外周血总HIV-1DNA和淋巴细胞以及亚群的水平及其动态变化。评价两组的血浆特异性抗体滴度和亲和力、中和抗体及胞间抑制抗体的活性，并以典型进展者(typical progressors，TPs)作为对照。测定血浆细胞因子水平，并与TPs和健康对照比较。分析病毒学和免疫学因素与HIV-1病毒控制的相关性。(2)利用单个B细胞分选技术，进行bNAbs的分选和制备。首先根据血浆中和活性确认LTNPs候选样本，针对其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分选单个HIV-1特异性记忆性B细胞，逆转录和巢氏PCR扩增抗体可变区基因并插入表达载体，在293T细胞和CHO-S细胞表达抗体，重组ProteinA进行抗体纯化后，通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定其抗原结合能力，以中和试验鉴定抗体的抗病毒生物学活性。
结果:(1)VC-LTNPs的HIV-1储存库水平显著低于non-VC-LTNPs(p=0.018)且保持稳定。(2)两组的淋巴细胞及其亚群在基线水平无显著差异，但在随访期间，VC-LTNPs的CD8+T细胞计数尤其激活的CD8+T细胞亚群比例显著低于non-VC-LTNPs，而CD4/CD8比值和CD8+CD28+T细胞比例高于non-VC-LTNPs。分析显示CD4/CD8比值与血浆病毒载量呈负相关，而激活的CD8+T细胞亚群比例与血浆病毒载量呈显著正相关。(3)HIV-1特异性抗体滴度和中和活性在TPs高于LTNPs(p＜0.05)，且抗体水平与血浆病毒载量呈正相关。(4)增殖诱导因子(a proliferation-inducing ligand，APRIL)、B细胞激活因子(B cell-activating factor，BAFF)和IFN-γ诱导蛋白10(interferon gamma-induced protein-10，IP-10)在组间有显著差异(p＜0.05)。APRIL水平在VC-LTNPs组显著升高，且与血浆病毒载量(r=-0.6078，p＜0.0001)和激活的CD8+T细胞比例(r=-0.3276，p=0.0106)以及炎症因子BAFF水平(r=-0.3072，p=0.0160)、IP-10水平(r=-0.4784，p=0.0016)和MCP-1(r=-0.4317，p=0.0048)呈显著负相关，而与CD4+T细胞绝对值和CD4/CD8比值呈显著正相关(r=0.2918，p=0.0225;r=0.3211，p=0.0116)。(5)血浆的中和效价和广谱度与患者的感染时长呈正相关(r=0.2999，p=0.0234;r=0.3333，p=0.0106);在59个血浆样本中，效价大于60以及广谱度高于50％的样本为6个。(6)分选单个细胞建立候选单抗库，包括181对抗体序列。重链基因分别来自6个不同的胚系基因1GHV1-2、IGHV1-69、IGHV3-11、IGHV3-15、IGHV4-38和IGHV4-59，体细胞突变频率在6.5％-32％之间;轻链来自2个不同的胚系基因IGKV1-5*03和IGKV1-33*01，突变频率分别为4％和21％。(7)表达和鉴定了8个单克隆抗体7D5、53、8A4、8E5、7F7、8F10、8H4和8H5，其中7D5的结合活性及中和活最强。7D5的活性可能与其高突变频率有关。(8)序列分析筛选得到2个候选抗体8G2和8H9，具有高突变频率和长HCDR3的特征。
结论:HIV-1储存库的大小影响血浆病毒载量和疾病进展，激活的T细胞与储存库水平密切相关，而APRIL水平与储存库大小及免疫激活呈显著负相关，提示低免疫激活和高水平的APRIL可能和病毒控制有关。APRIL作为独特的细胞因子，对其进一步研究可能会为LTNPs自发控制病毒的机制提供新的线索。bNAbs中和效价和广谱度的获得需要病毒与抗体长期共进化，LTNPs为bNAbs的产生和成熟提供了有利条件。分选所获抗体特征提示体细胞突变频率可能会影响抗体的结合活性以及中和活性，以此继续筛选高突变频率的抗体，有望获得高效且广谱的中和抗体，进而为HIV-1感染提供更多潜在的防治策略。
方法:(1)根据血浆病毒载量的动态变化，将LTNPs分为病毒学控制组(viremic control，VC-LTNPs)和病毒学进展组(non-VC-LTNPs)。检测VC-LTNPs和non-VC-LTNPs的外周血总HIV-1DNA和淋巴细胞以及亚群的水平及其动态变化。评价两组的血浆特异性抗体滴度和亲和力、中和抗体及胞间抑制抗体的活性，并以典型进展者(typical progressors，TPs)作为对照。测定血浆细胞因子水平，并与TPs和健康对照比较。分析病毒学和免疫学因素与HIV-1病毒控制的相关性。(2)利用单个B细胞分选技术，进行bNAbs的分选和制备。首先根据血浆中和活性确认LTNPs候选样本，针对其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分选单个HIV-1特异性记忆性B细胞，逆转录和巢氏PCR扩增抗体可变区基因并插入表达载体，在293T细胞和CHO-S细胞表达抗体，重组ProteinA进行抗体纯化后，通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定其抗原结合能力，以中和试验鉴定抗体的抗病毒生物学活性。
结果:(1)VC-LTNPs的HIV-1储存库水平显著低于non-VC-LTNPs(p=0.018)且保持稳定。(2)两组的淋巴细胞及其亚群在基线水平无显著差异，但在随访期间，VC-LTNPs的CD8+T细胞计数尤其激活的CD8+T细胞亚群比例显著低于non-VC-LTNPs，而CD4/CD8比值和CD8+CD28+T细胞比例高于non-VC-LTNPs。分析显示CD4/CD8比值与血浆病毒载量呈负相关，而激活的CD8+T细胞亚群比例与血浆病毒载量呈显著正相关。(3)HIV-1特异性抗体滴度和中和活性在TPs高于LTNPs(p＜0.05)，且抗体水平与血浆病毒载量呈正相关。(4)增殖诱导因子(a proliferation-inducing ligand，APRIL)、B细胞激活因子(B cell-activating factor，BAFF)和IFN-γ诱导蛋白10(interferon gamma-induced protein-10，IP-10)在组间有显著差异(p＜0.05)。APRIL水平在VC-LTNPs组显著升高，且与血浆病毒载量(r=-0.6078，p＜0.0001)和激活的CD8+T细胞比例(r=-0.3276，p=0.0106)以及炎症因子BAFF水平(r=-0.3072，p=0.0160)、IP-10水平(r=-0.4784，p=0.0016)和MCP-1(r=-0.4317，p=0.0048)呈显著负相关，而与CD4+T细胞绝对值和CD4/CD8比值呈显著正相关(r=0.2918，p=0.0225;r=0.3211，p=0.0116)。(5)血浆的中和效价和广谱度与患者的感染时长呈正相关(r=0.2999，p=0.0234;r=0.3333，p=0.0106);在59个血浆样本中，效价大于60以及广谱度高于50％的样本为6个。(6)分选单个细胞建立候选单抗库，包括181对抗体序列。重链基因分别来自6个不同的胚系基因1GHV1-2、IGHV1-69、IGHV3-11、IGHV3-15、IGHV4-38和IGHV4-59，体细胞突变频率在6.5％-32％之间;轻链来自2个不同的胚系基因IGKV1-5*03和IGKV1-33*01，突变频率分别为4％和21％。(7)表达和鉴定了8个单克隆抗体7D5、53、8A4、8E5、7F7、8F10、8H4和8H5，其中7D5的结合活性及中和活最强。7D5的活性可能与其高突变频率有关。(8)序列分析筛选得到2个候选抗体8G2和8H9，具有高突变频率和长HCDR3的特征。
结论:HIV-1储存库的大小影响血浆病毒载量和疾病进展，激活的T细胞与储存库水平密切相关，而APRIL水平与储存库大小及免疫激活呈显著负相关，提示低免疫激活和高水平的APRIL可能和病毒控制有关。APRIL作为独特的细胞因子，对其进一步研究可能会为LTNPs自发控制病毒的机制提供新的线索。bNAbs中和效价和广谱度的获得需要病毒与抗体长期共进化，LTNPs为bNAbs的产生和成熟提供了有利条件。分选所获抗体特征提示体细胞突变频率可能会影响抗体的结合活性以及中和活性，以此继续筛选高突变频率的抗体，有望获得高效且广谱的中和抗体，进而为HIV-1感染提供更多潜在的防治策略。