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动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病(coronary heart disease,CHD)发生的主要病因,是严重危害人类健康的一类疾病。AS的形成是个慢性脂质沉积及慢性炎症反应的过程,在病变早期,血液循环中的单核细胞迁移到血管内皮下分化为巨噬细胞并吞噬氧化型低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein,ox-LDL),造成细胞内大量的脂质堆积并诱发巨噬细胞炎症反应,从而形成泡沫细胞。在巨噬细胞对ox-LDL失去控制的吸收中,过量的胆固醇在细胞内脂滴中的蓄积被认为是泡沫化形成的扳机。而CD36作为巨噬细胞吸收ox-LDL及胆固醇的主要受体,在动脉粥样硬化的病理过程中,发挥着关键作用。脂质代谢与巨噬细胞炎症反应之间又存在着相互作用,如炎症因子IL-1β、TNF-α破坏了低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)的反馈机制,使LDLR持续表达,增加了细胞内胆固醇的水平,并促进脂蛋白的氧化,从而加重脂代谢的失衡;而脂代谢紊乱可以促进巨噬细胞从M2型(抑炎)向M1型(促炎)转变。因此,研究巨噬细胞对炎症反应及脂质摄取的调节作用及机制对了解动脉粥样硬化的发生发展机制具有重要的意义。微小RNA分子(micro RNAs,mi RNAs)是短链非编码的小RNA分子,其通过靶向结合于目的m RNAs在转录后水平调节基因的表达,或者使靶标m RNAs降解在转录水平进行调节。近年来研究表明,多种mi RNA在巨噬细胞摄取胆固醇、诱导炎症反应中发挥着重要作用,其中微小分子RNA-155(micro RNA-155,mi RNA-155)是关注的焦点。研究表明,在小鼠AS斑块中mi RNA-155高表达,并参与促进了斑块的形成;在巨噬细胞中,mi R-155既可以调控细胞对ox-LDL的摄取,又可激活STAT3、NF-κB等炎症信号通路并促进下游炎症因子IL-6、TNF-α等的表达。说明mi R-155在巨噬细胞脂质摄取及炎症反应这一系列事件中发挥着重要作用,但是mi R-155通过何种途径同时对脂质摄取、炎症反应发挥作用尚不清楚。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated-receptors,PPAR)是一类由配体激活的核转录因子,属于受体超家族成员。目前已发现有PPARα、PPARβ、PPARγ三种亚型,其中PPARγ主要在脂肪组织、单核/巨噬细胞等中高表达。大量研究表明,PPARγ在巨噬细胞中不仅发挥着调控炎症反应的作用,也在调控胆固醇摄取中发挥着关键作用。酒精处理的巨噬细胞中,mi R-155可调控PPARγ的表达,进而影响炎症因子的表达水平。为了探索mi R-155在巨噬细胞炎症反应和脂质摄取中的作用及机制,本研究采用ox-LDL诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞泡沫化形成,分三部分进行研究:第一部分观察不同处理mi RNA-155、PPARγ对巨噬细胞脂质摄取的调节作用;第二部分观察不同处理mi RNA-155、PPARγ对巨噬细胞炎症反应的调节作用。第三部分观察不同处理mi RNA-155对巨噬细胞PPARγ蛋白表达的调节作用。第一部分:mi R-155与PPARγ对巨噬细胞脂质摄取的调节方法:1.用0、25、50、100μg/m L ox-LDL刺激RAW264.7细胞24 h和50μg/m L ox-LDL分别处理细胞0、6、12、24 h后,应用RT-PCR法检测细胞mi R-155的水平。2.利用LipofectaminTM2000分别将50 pmol/L mi R-155拮抗物、阴性对照转染细胞或者PPARγ-短发夹RNA、阴性对照腺病毒感染细胞24h后,50μg/m L ox-LDL刺激24h。分为对照组、ox-LDL处理组、ox-LDL/阴性对照组、ox-LDL/mi R-155拮抗物组、ox-LDL/sh RNA阴性对照组、ox-LDL/PPARγ-sh RNA组。用油红O染色观察细胞内脂滴沉积、胆固醇检测试剂盒检测细胞总胆固醇(TC)和游离胆固醇(FC)含量、Fillipin染色再次观察细胞游离胆固醇(FC)蓄积情况。Western blot法检测CD36的蛋白水平。结果:1.随着ox-LDL处理剂量和时间的增加,mi R-155的表达水平逐渐升高。2.ox-LDL/mi R-155拮抗物组油红O染色相对吸光度(A)值、TC和FC含量、Filipin的平均荧光强度低于ox-LDL组、ox-LDL/阴性对照组;同样地,ox-LDL/PPARγ-sh RNA组油红染色A值、TC和FC含量、Filipin的平均荧光强度低于ox-LDL组、ox-LDL/sh RNA阴性对照组。3.ox-LDL/mi R-155拮抗物组CD36的蛋白表达水平低于ox-LDL组、ox-LDL/阴性对照组;同样地,ox-LDL/PPARγ-sh RNA组CD36的蛋白表达水平低于ox-LDL/sh RNA阴性对照组。结论:ox-LDL刺激上调RAW264.7巨噬细胞中mi RNA-155的表达及细胞膜CD36受体的表达。而拮抗mi RNA-155、沉默PPARγ可降低CD36的表达,减少细胞对脂质的摄取,使细胞内脂滴沉积及胆固醇含量降低。第二部分:mi R-155与PPARγ对巨噬细胞炎症反应的调节方法:利用LipofectaminTM2000分别将50 pmol/L mi R-155拮抗物、阴性对照转染细胞或者PPARγ-短发夹RNA、阴性对照腺病毒感染细胞24h后,50μg/m L ox-LDL刺激24h。分为对照组、ox-LDL处理组、ox-LDL/阴性对照组、ox-LDL/mi R-155拮抗物组、ox-LDL/sh RNA阴性对照组、ox-LDL/PPARγ-sh RNA组。Western blot法检测p-STAT3和NF-κB p65的蛋白水平。RT-PCR法检测TNFα、IL-6和IL-1βm RNA的水平。结果:1.ox-LDL/mi R-155拮抗物组p-STAT3、NF-κB p65的蛋白表达水平低于ox-LDL组、ox-LDL/阴性对照组;同样地,ox-LDL/PPARγ-sh RNA组p-STAT3、NF-κB p65蛋白表达水平低于ox-LDL/sh RNA阴性对照组。2.ox-LDL/mi R-155拮抗物组TNF-α、IL-6和IL-1βm RNA表达水平低于ox-LDL组、ox-LDL/阴性对照组;同样地,ox-LDL/PPARγ-sh RNA组TNF-α、IL-6和IL-1βm RNA表达水平低于ox-LDL/sh RNA阴性对照组。结论:ox-LDL刺激可激活巨噬细胞炎症信号通路分子并促进炎症因子的释放,而拮抗mi R-155、沉默PPARγ可逆转ox-LDL介导的巨噬细胞炎症信号通路的激活及炎症因子的释放。第三部分:mi R-155对巨噬细胞内PPARγ表达的调节方法:利用LipofectaminTM2000分别将50 pmol/L mi R-155拮抗物、阴性对照转染细胞24h后50μg/m L ox-LDL刺激24h,分为对照组、ox-LDL处理组、ox-LDL/阴性对照组、ox-LDL/mi R-155拮抗物组,Western blot法检测PPARγ的蛋白水平。结果:ox-LDL处理组、ox-LDL/阴性对照组中PPARγ蛋白表达高于对照组;ox-LDL/mi R-155拮抗剂组中PPARγ蛋白表达低于ox-LDL组、ox-LDL/阴性对照组。结论:mi R-155可通过调控PPARγ,影响STAT3/NF-κB信号通路及CD36的表达,进而影响巨噬细胞的炎症反应和脂质摄取。