研究背景血脑屏障主要是指单层的血管内皮细胞构成的脑毛细血管壁,其能够选择性地使血液中的溶质进入到脑组织中,为脑组织创造了一个健康的微环境,对维持中枢神经系统的正常生理活动有重要的作用。创伤性脑外伤作为血脑屏障损伤最严重的中枢神经系统疾病,已经成为世界上高致死率和致残率的主要疾病。患者在脑外伤后,血脑屏障的功能失调,使血液中大量的炎症分子进入到脑组织,造成中枢神经系统的二次损伤,是创伤性脑外伤治疗的难点所在。到目前为止,已经报道过有很多分子通路参与·了生理状态下血脑屏障的功能调控,但是在中枢神经系统疾病状态下参与血脑屏障功能调控的分子十分有限。膜联蛋白(Annexins)家族是钙离子依赖的磷脂结合蛋白家族,膜联蛋白A2(Annexin A2)作为其中的一个重要成员,在自身免疫疾病、出血综合症以及肿瘤等疾病的发生发展中起着重要的作用,但其在血脑屏障中的作用目前尚不清楚。近年来,有研究发现膜联蛋白A1(Annexin Al)能够调节血管内皮细胞的骨架分布以及细胞间的紧密程度。由于Annexins家族具有高度保守的功能结构域,而膜联蛋白A2也参与调控细胞膜的转运活动(内吞和胞吐),故在本研究中,我们提出假设：膜联蛋白A2是一个调控血脑屏障功能的重要分子,是一个治疗因血脑屏障失调导致的中枢神经系统疾病潜在靶点。本研究的阐明,为筛选治疗创伤性脑外伤潜在的分子靶点提供了理论基础,为设计更加高效地保护血脑屏障功能失调的药物提供了新的方向,具有重要的临床意义,是当前迫切需要探索和解决的重要科学前沿问题。研究方法胚胎期血脑屏障功能测定孕鼠吸入麻醉后,将胚胎暴露,脐带仍然和母体相连,使用Hmailton注射器将5μl示踪剂注射进入胚胎的肝脏中(4 mg/ml),使染料通过肝脏循坏三分钟,然后取胚胎脑组织放入4%多聚甲醛中,冷室过夜,次日放入30%蔗糖溶液中脱水。成年鼠血脑屏障功能测定小鼠吸入麻醉后,暴露心脏,将10-15 ml EZ连接NHS磺基生物素(0.5 mg/ml)通过左心室注入,循环五分钟后,使用磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate buffered saline, PBS)灌注。取出脑组织放入4%多聚甲醛中,冷室过夜,次日放入30%蔗糖溶液中脱水。受控皮质冲击手术模型暴露解剖标志LAMBDA (尾椎方面)和前囟门(正面的方面)。在LAMBDA和前囟门和(1毫米远离中线)绘制中心圆(直径5毫米)。使用钻孔沿标记的圆圈切割,镊子去除骨暴露硬脑膜。致动器的速度：5米／秒；变形深度：0.6毫米；调节笔尖(直径3毫米)在平行于冲击部位的表面的角度。细胞渗透性实验将HBMEC接种于胶原蛋白铺垫过的1.0μm迁移小室中,将小室置于24孔板中,给药处理后,加入辣根过氧化物酶至小室的培养基中,终浓度为100 μg/ml;60分钟后,收集小室下面孔中的培养基,加入邻甲氧基苯酚和双氧水,至终浓度为0.5 mM(邻甲氧基苯酚),0.6 mM(双氧水)。显色后,在吸收波长为490 nm的酶标仪中测量从小室中渗漏出的辣根过氧化物酶的量。研究结果1.膜联蛋白A2在血脑屏障功能形成和成熟中的重要作用在野生型小鼠和A2-/-小鼠胚胎期13.5天,10 kDa的示踪剂已经聚集于野生型小鼠的脑血管中,没有渗漏现象。在A2-/-小鼠皮层位置,却观察到该示踪剂有渗漏现象。在A2-/-小鼠胚胎期15.5天,10kDa示踪剂也聚集于脑血管中,表明随着发育,A2-/-小鼠的血脑屏障功能也在完善。值得注意的是,在A2-/-小鼠胚胎期15.5天,550 Da小分子示踪剂仍然存在渗漏,野生型小鼠却没有渗漏。在出生后4天以及成年12周的野生型小鼠和A2-/-小鼠的脑组织中,也观察到了同样的现象。以上的实验结果均提示膜联蛋白A2参与血脑屏障功能形成和成熟,并且膜联蛋白A2的缺失会导致血脑屏障对小分子的渗漏增加。提取三个月大的野生型小鼠和A2-/-小鼠的脑微血管内皮细胞,分析连接复合体的表达水平。结果表明,与野生型小鼠比较,紧密连接蛋白：ZO-1、Claudin-5、粘附连接蛋白VE-cadherin的表达在A2-/-小鼠脑微血管中明显降低。以上实验证明膜联蛋白A2的缺失会造成血脑屏障的功能失调。2.膜联蛋白A2对创伤性血脑屏障损伤的保护作用受控皮质冲击手术(Controlled cordical impact models, CCI)后24小时,通过尾静脉注射10 kDa的荧光示踪剂可以发现A2-/-小鼠血管渗漏的程度高于野生型小鼠。在埃文斯蓝测定血脑屏障功能的实验中,也得到了相似的结果。随后提取脑血管内皮细胞,对连接复合体的表达进行了检测,发现相对于野生型小鼠,A2-/-小鼠中紧密连接蛋白：ZO-1、Occludin、Claudin-5、粘附连接蛋白：VE-cadherin的表达均明显降低。以上实验均表明膜联蛋白A2的缺失造成了脑外伤对血脑屏障更严重的损伤。CCI手术后2小时,尾静脉注射不同剂量的重组膜联蛋白A2(Recombinant annexin A2, rA2),结果显示相对于牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum, BSA)对照组,给予rA2 (0.75 mg/kg-1.5 mg/kg)能有效地降低血管的渗漏。更重要的是,即使在CCI手术后6小时给予rA2 (1 mg/kg)也能有效地降低血管的渗漏。同时,CCI手术后1小时给予rA2 (1 mg/kg)的治疗能有效地增加紧密连接蛋白：ZO-1和粘附连接蛋白：VE-cadherin的表达。以上均证明了重组膜联蛋白A2能够有效的逆转脑外伤造成的血脑屏障功能失调,并且增加连接复合体的蛋白表达水平。在体外试验中,使用小干扰RNA (Small interfering RNA, siRNA)将人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cell, HBMEC)中膜联蛋白A2表达沉默,我们发现细胞间的渗透性显著高于对照组。在单层紧密的HBMEC中加入炎症分子白介素-1β (Interlukin 1β, IL-1β),细胞的渗透性显著增加,而rA2可以逆转这种损伤。进一步,创伤性脑外伤在体外模拟模型：IL-1β+缺氧混合模型能明显增加HBMEC的渗透性,而rA2也能逆转这种损伤。提取HBMEC的细胞膜蛋白,并对连接复合体的表达进行了检测。Ⅲ-1β+缺氧能降低所有连接复合体蛋白的表达,而给予rA2后,能显著增加ZO-1和VE-cadherin在细胞膜上的表达。以上实验表明,rA2通过影响ZO-1和VE-cadherin的表达以及在细胞中的分布来保护Ⅲ-1β+缺氧造成的血管内皮细胞渗透增加。3.膜联蛋白A2对创伤性血脑屏障损伤的保护作用机制提取人脑微血管内皮细胞的膜蛋白,使用膜联蛋白A2的特异性单克隆抗体进行免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)。结果显示膜联蛋白A2能够和细胞膜上粘附连接蛋白VE-cadherin以及细胞骨架蛋白F-actin相互结合。IL-1β+缺氧能够减少膜联蛋白A2在HBMEC胞膜上的分布,而给予rA2后,细胞膜上膜联蛋白A2的量明显增加。这也导致膜联蛋白A2和VE-cadherin、F-actin的相互作用增加,进而稳定VE-cadherin和F-actin在脑血管内皮细胞膜上的分布,增加细胞的紧密连接性。IL-1β+缺氧明显激活了小G蛋白酶ARF6,而rA2能够抑制ARF6的激活。利用siRNA沉默内源性膜联蛋白A2的表达,细胞内的ARF6被明显激活。使用ARF6的特异性激活剂QS11能降低连接复合体的表达水平,而rA2能够逆转ZO-1和VE-cadherin的减少。使用ARF6的特异性抑制剂SecinH3,能够抑制IL-1β+缺氧造成的ZO-1和VE-cadherin在细胞膜上表达的降低,而rA2的作用并没有强于SecinH3+rA2组保护作用。以上实验表明：rA2调控血脑屏障连接复合体的表达主要依赖于ARF6通路。研究结论膜联蛋白A2参与血脑屏障功能的形成和成熟,膜联蛋白A2的缺失使胚胎期血脑屏障出现损伤,并且该损伤能伴随至成年。在生理情况造成小分子的渗漏,也会加重创伤性脑外伤导致的血脑屏障损伤。外源给予重组的膜联蛋白A2能够保护创伤性脑外伤造成的血脑屏障渗漏,避免二次损伤的发生。膜联蛋白A2能通过和脑血管内皮细胞膜上的粘附连接蛋白VE-cadherin.细胞骨架蛋白F-actin相互作用,稳定它们在膜上的分布。同时,外源性给予重组膜联蛋白A2能抑制ARF6分子的活化从而增加连接复合体在膜上的表达,增加脑血管内皮细胞间的紧密连接性。该研究不仅拓展了膜联蛋白A2的功能以及其作用机制,更为以后对中枢神经系统疾病的治疗提供了新的思路和方向。