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牛结核病是分枝杆菌属牛分枝杆菌引起的一种人畜共患的慢性消耗性传染病,可以导致包括人和家畜以及野生动物的发病,被国际动物卫生组织(OIE)列为必须通报疫病。全球每年因结核病而使养牛业产生的直接经济损失约为30亿美元。据统计,全世界约10%以上的人结核病是由牛分枝杆菌引起的。因此,牛结核病给畜牧业的发展和人类健康带来重大影响,也同时成为世界性的公共卫生问题。深入探讨牛结核分枝杆菌的致病机制,可以为牛结核的新型诊断方法和疫苗的设计提供理论依据。牛分枝杆菌是胞内菌,主要寄生于巨噬细胞(macrophage,Mφ)和树突状细胞(dendritic cells, DCs),因此感染后以诱导细胞免疫为主。树突状细胞是目前发现的抗原递呈能力最强、唯一能在体内激活初始性T淋巴细胞的专职抗原递呈细胞。因此应用树突状细胞作为牛分枝杆菌的模式细胞,对于研究牛结核的免疫和致病机制具有重大意义。持续感染和免疫抑制是结核病防控面临的重要挑战。前列腺素(prostaglandin,PG)E2是重要的免疫调节和促炎因子,能通过调节抗原递呈细胞的细胞因子分泌控制细胞免疫和体液免疫的平衡。本实验室前期基因芯片结果表明毒力牛分枝杆菌较BCG能诱导更高水平的PGE2合成相关基因。因此,本研究继续深入分析毒力牛分枝杆菌和BCG感染树突状细胞后PGE2的合成通路及PGE2对感染后的免疫调节机制。主要获得以下结果：1.毒力牛分枝杆菌显著诱导树突状细胞PGE2的产生牛分枝杆菌弱毒株BCG及毒力株型牛分枝杆菌感染DCs后,用ELSIA方法检测细胞培养上清中PGE2的分泌情况。结果显示未感染的DCs中PGE2浓度较低,感染后1h,6h,12h和24h表达量分别为176.49±13.12 pg/mL,187.44±11.43 pg/mL,320.39±14.46 pg/mL和344.40±16.35 pg/mL。BCG和毒力牛分枝杆菌感染后,DCs中PGE2的表达都显著上调。牛分枝杆菌感染后1,6,12,和24 h PGE2的浓度分别为837.32±22.57 pg/mL,1370.03±101.72 pg/mL,1299.70±98.93 pg/mL和2057.28±173.03 pg/mL,BCG感染后1,6,12和24 h PGE2的浓度分别为405.8±17.54 pg/mL,860.32±65.68 pg/mL,833.54±53.95 pg/mL和1133.27±87.61pg/mL。在所研究的四个感染时间点中,毒力牛分枝杆菌处理组中PGE2的水平都显著高于BCG感染组(P值均<0.05)。2.树突状细胞感染不同毒力牛分枝杆菌后相关细胞因子的表达应用ELISA检测试剂盒检测感染后DCs分泌细胞因子的情况,包括Thl型相关细胞因子(IFN-γ,IL-12和TNF-α),Th2型相关细胞因子(IL-4和IL-10)及Th17型相关细胞因子(IL-17A,IL-6和IL-23)。其中,BCG感染的DCs分泌IL-12和TNF-a的能力都显著高于毒力牛分枝杆菌感染组(P<0.01,P<0.05)。IL-4, IFN-γ和IL-6在牛分枝杆菌和BCG感染的DCs中表达量相当；但与未感染细胞相比,感染后能强烈刺激IL-6的表达(P<0.01)。IL-17A的表达在各处理组之间没有显著变化,而IL-23在牛分枝杆菌感染组中表达最高,显著高于BCG感染组(P<0.05)；在未感染细胞中表达最低,显著低于BCG感染组(P<0.05)。毒力牛分枝杆菌或BCG感染后都能促进DCs中IL-10的表达。3.PGE2代谢相关基因的表达用荧光定量PCR检测了PGE2合成相关基因COX-2, mPGES-1, mPGES-2和cPGES在感染后的相对表达量。组成型基因在mPGES-2和cPGES均只在毒力型牛分枝杆菌感染后6小时处显著上调,mPGES-2和cPGES相对表达量分别是BCG感染组的2.5倍和4倍。半定量RT-PCR结果也表明感染6h和12h后,组成型基因COX-1在牛分枝杆菌感染的DCs的相对表达量分别是BCG感染组的3.7倍和1.6倍。BCG感染组的DCs中诱导型基因COX-2和mPGES-1的表达仅在感染后24小时显著上调,这一结果也用Western blotting方法得到了验证。4.PGE2水平对树突状细胞成熟与分化的影响在骨髓来源的干细胞向DCs定向培养的第7天,分别加入不同浓度的PGE2发现：PGE2能刺激DCs表面MHC-Ⅱ和共刺激分子CD40、CD80和CD86的上调表达；适量水平(2.5μg/mL)的PGE2能使这种上调效果达到最佳。同时发现分别加入0.5μg/mL,2.5μg/mL和5μg/mL的PGE2后,DCs细胞表面分子CDllc的比例由87.34±1.94%分别下降至74.48±1.78%,75.81±2.31%和70.48±2.46%(P值均<0.05),说明一定浓度的PGE2能抑制骨髓干细胞向树突状细胞的分化。5.PGE2对初始CD4+T细胞分化的调控作用为研究PGE2对细胞免疫调节的影响,利用不同毒力牛分枝杆菌感染后的DCs培养上清与初始CD4+T细胞共同作用。共同孵育24h后检测CD4+T细胞分化后细胞因子的分泌水平的变化情况,其中包括IL-4,IL-12,IFN-γ和IL-17A。同时在感染的DCs中设置添加PGE2合成抑制剂的对照。BCG感染后的DCs刺激CD4+T后, IL-12分泌量超过160 pg/mL,显著高于牛分枝杆菌处理组(IL-12分泌量小于20 pg/mL,P<0.01),抑制PGE2的产生的同时导致了IL-12合成的急剧减少(P<0.01)。毒力牛分枝杆菌和BCG感染的DCs作用CD4+T细胞后表达几乎同等水平的IL-17A,抑制PGE2均导致牛分枝杆菌和BCG处理中IL-17A的显著降低(P<0.05)。毒力牛分枝杆菌处理组表达最少的IL-4,其次是BCG处理组,空白组表达量最高。PGE2的抑制均导致刺激后CD4+T细胞中IL-4的降低。IFN-γ在未经感染的DCs作用的CD4+T细胞处理组中表达最高。毒力牛分枝杆菌和BCG感染的DCs作用CD4+T细胞后,都能显著上调Foxp3 mRNA的表达(P<0.01),上调倍数达到8.8倍和4.0倍。同时,Foxp3 mRNA在毒力牛分枝杆菌处理组和BCG处理组之间的表达差异也达到显著水平(P<0.05)。PGE2抑制后能显著降低刺激后T细胞中Foxp3的水平,提示牛分枝杆菌感染后可能通过PGE2的水平调节CD4+T细胞向调节性T细胞(Treg)的方向发展。