青稞条纹病相关NB-ARC家族生物信息学分析及候选基因功能验证

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青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.)是我国青藏高原地区主要的粮食作物,称为裸大麦。条纹病是大麦生产过程中一种常见的真菌性种传病害,条纹病害一旦发生会引起青稞产量的大幅度降低,也会严重影响青稞的品质。本研究利用大麦参考基因组信息筛选了大麦NB-ARC基因家族,利用前期全长转录组和转录组测序结果,确定条纹病相关候选基因Hvn RPS2和Hvn RGA3。分析他们在条纹病胁迫下的表达模式。通过VIGS技术验证了Hvn RPS2基因的抗条纹病功能,初步揭示了该基因在青稞抗条纹病过程中发挥的作用。主要研究结果下:1.基于大麦参考基因组鉴定了298个NB-ARC家族成员,进行了染色体定位,分析了基因结构、蛋白结构域和motif、蛋白进化及与拟南芥、玉米和水稻的共线性关系。结果显示,298个大麦NB-ARC基因不均匀分布在大麦七条染色体上;298个大麦NB-ARC基因家族成员之间基因和蛋白结构存在较大差异,被分为9组;绝大部分家族成员的同义突变不受自然选择压力;大麦与拟南芥不存在共线性关系,大麦与玉米、水稻中分别发生了7对和9对复制事件。2.利用前期抗病青稞品种‘昆仑14号’和感病青稞品种‘Z1141’在条纹病胁迫下的转录组和全长转录组测序结果,大麦298个NB-ARC基因中有7个差异表达的NB-ARC基因。GO分析显著富集它们主要集中在细胞和代谢过程中;KEGG分析发现一个NB-ARC基因(基因ID:HORVU2Hr1G089020)富集在植物病和原菌互作的通路中。转录组分析结果表明,条纹病胁迫下,Hvn RPS2和Hvn RGA3(基因ID:HORVU2Hr1G087730)表达量显著降低和升高,根据以上研究结果确定Hvn RPS2和Hvn RGA3为青稞抗条纹病相关基因。3.通过同源克隆技术,从‘昆仑14’和‘Z1141’叶片中克隆了Hvn RPS2和Hvn RGA3基因。序列分析表明,Hvn RPS2碱基序列和其编码的氨基酸序列在两品种中一致性均为100%;Hvn RGA3编码的氨基酸序列一致性分别为98.25%。q RT-PCR表明,随着条纹病胁迫时间的延长,抗病青稞品种‘昆仑14’和感病青稞‘Z1141’的Hvn RPS2和Hvn RGA3基因呈先降低后升高再下降的表达模式;与正常叶片相比,感病叶片的基因表达量极显著下调,且抗病品种的表达量下调值显著高于感病品种。推测Hvn RPS2和Hvn RGA3基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要的负反馈调节。4.通过VIGS技术初步验证了Hvn RGA3基因的抗条纹病功能。半定量以及荧光定量检测结果表明,Hvn RGA3基因表达量显著降低后,叶片抗病能力明显高于对照组,表明Hvn RGA3基因沉默能够提高青稞的抗条纹病功能,说明Hvn RGA3基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要的负反馈作用。本研究结果为青稞NB-ARC类基因在抗病育种中的研究提供了新思路。
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