高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是广泛存在于真核细胞核中最重要的非组蛋白之一，具有多种核外生物学功能，尤其是作为细胞因子广泛参与炎症反应。大量研究表明HMGB1在心血管疾病的发生发展中起重要作用，在心肌梗死动物模型，HMGB1能够促进梗死心肌修复，对心衰具有治疗作用；但在急性缺血，再灌注模型，HMGB1却促进心衰发生。以往研究观察到HMGB1具有诱发心律失常的作用，但其机制尚未研究。心肌细胞膜瞬间外向钾电流（transient outward current，Ito）是一种电压依赖性的钾通道，膜电位去极化时激活，具有快速激活和快速失活的特性，是构成动作电位（action potential，AP）复极化1期的主要钾电流，同时也是啮齿类动物复极化的主要钾电流，其改变对AP时程有重要影响，是疾病条件下引起心律失常的重要原因。本研究探讨HMGB1对Ito电流的影响及其对心电稳定性的影响，为心衰心律失常的发生机制提供理论依据，同时也为HMGB1临床应用的评估提供依据。 一、HMGB1对乳鼠心肌细胞Ito电流密度和动力学的调节。 细胞钳制在-80 mV，给予250 ms、从-50 mV开始以10 mV递增到+60 mV的电压刺激以激活Ito。同时在细胞灌流液中加入20 μM的TTX （Tetrodotoxin）以阻断钠电流，200 μM CdCl2阻断钙电流。将各电压下记录的Ito电流幅度（pA），除以细胞电容（pF）得出电流密度（pA/pF）。结果表明，HMGB1电流密度在-10～+60 mV的电压范围内均显著低于对照组P<0.05。在此基础上，根据（Ⅰ-Ⅴ）曲线，计算出标准化激活稳态（gm）的曲线，以-60 mV处为反转电位，运用Boltzmann公式拟合，估算半数激活电压（V0.5），从而得到电压赖激活曲线。HMGB1对Ito电压依赖性激活无显著影响，对照组与HMGB1组电压依赖性激活曲线无明显变化，V0.5分别为22.03±2.53 mV （n=6）和17.32±4.08 mV （n=7），t=0.939，P=0.368>0.05，两组之间也无统计学意义。对对照组和HMGB1组的电容分析发现，HMGB1可以使乳鼠心肌细胞体积变大，对照组和HMGB1组的细胞电容分别为23.43±1.56 pF （n=29）和28.75±1.86pF （n=21），t=-2.193，P=0.033，两组比较差异有统计学意义，提示HMGB1可能具有引起心肌细胞肥大的作用。 二、HMGB1延长心肌动作电位时程（APD）。 鉴于Ito在AP形成中的重要作用，HMGB1可能通过抑制Ito而延长AP时程（action potential duration， APD）。正如我们所预期的，HMGB1组APD显著延长。对两组APD复极到0mV和复极到-60mV的时程进行统计学分析，对照组APD0和APD-60分别为24.68±3.39 ms和114.94±19.73 ms（n=11），HMGB1组APD0和APD-60较对照组显著延长，分别为52.92±10.25 ms和225.97±26.85ms（n=11），to=-2.617，P0=0.017，t-60=-3.33，P-60=0.003。结果表明，HMGB1异常升高可能会导致心律失常的发生。而静息膜电位（resting membrane potential，RPM）两组之间差异无显著性。 三、HMGB1降低Kv4.2和Kv4.3的蛋白表达。 Ito由α亚基（包括Kv4.2、Kv4.3）和β亚基（主要为KChIP2，KCNE2可能也参与Ito功能的调节）构成。本实验发现HMGB1使乳鼠心肌细胞Kv4.2、Kv4.3蛋白的表达量显著降低，分别为对照组的76.3%和51.4%，但对Ito的β亚基KChIP2，KCNE2蛋白的表达量无显著影响。结果表明，HMGB1抑制Ito的一个重要机制是减少其α亚基的表达量。 四、HMGB1对Ito电流的影响可能与RAGE通路有关。 以往研究发现，HMGB1可通过糖基化终产物受体（receptor of advanced glycation end product，RAGE）和Toll样受体（Toll like receptor， TLR）发挥生物学效应。本研究发现，利用可溶性RAGE（sRAGE）阻断RAGE受体后，HMGB1对瞬间外向钾电流（Ito）的抑制作用显著减低。虽然HMGB1和HMGB1+sRAGE组电流密度在-10～+60 mV的电压范围内均显著低于对照组（P<0.05），但HMGB1+sRAGE组电流密度在-10～+60 mV的电压范围内显著高于HMGB1组。结果表明，HMGB1部分通过RAGE抑制Ito。 五、HMGB1对单独表达的Kv4.3的影响。 1. HMGB1对Kv4.3通道电流密度和动力学的影响。 COS-7细胞转染Kv4.3基因，24h后记录Kv4.3通道电流及不同剂量HMGB1对Ito电流密度的影响。结果表明，HMGB1呈剂量依赖性抑制Ito。对照组、HMGB1（50ng/ml）组、HMGB1（100ng/ml）组和HMGB1（200ng/ml）组Ito电流密度分别为（374.63±49pA/pF，n=19），（329.16±86pA/pF，n=9）（178.52±57pA/pF，n=6）（71.91±10pA/pF，n=8），在HMGB1的浓度为100ng/ml和200ng/ml时，电流密度与对照组相比差异有显著性，P=0.048和P=0.035。HMGB1对通道激活和失活的动力学无显著影响。对照组和HMGB1组在+60mV所产生电流达到峰值的时间（time to peak，TTP）为4.16±0.40ms，（n=14）和4±0.30ms（n=9）t=0.288，P=0.776，差异无显著性。电流峰值衰减一半的时间T0.5分别为33.80±2.33ms（n=14）和36.53±3.75ms（n=9），t=-0.253，P=0.521>0.05，差异无显著性。 2. HMGB1对Kv4.3通道电压依赖性激活的影响。 细胞钳制在-80mV，给予细胞250ms、从-50mV开始以10mV递增到+60mV的电压刺激，记录各电压下Ito电流幅度（pA），将电流幅度除以细胞电容（pF）得出电流密度（pA/pF）。结果表明，HMGB1组电流密度在-20～+60mV的电压范围内均显著低于对照组P<0.05。为观察HMGB1对Kv4.3通道电压依赖性激活动力学特征的影响，在此基础上，根据（Ⅰ-Ⅴ）曲线，计算出标准化激活稳态（gm）的曲线，以-60mV处为反转电位，运用Boltzmann公式拟合，估算半数激活电压（V0.5），从而得到电压赖激活曲线。HMGB1对Ito电压依赖性激活无显著影响。对照组与HMGB1组电压依赖性激活曲线无明显变化，V0.5分别为-4.84±1.46mV（n=10）和-6.92±2.76mV（n=8）P=0.525>0.05，说明HMGB1不改变Kv4.3的离子选择性。 3. HMGB1对Kv4.3通道电压依赖性失活的影响。 HMGB1对Kv4.3通道电压依赖性失活的影响，将细胞钳制在-80mV，给予2s，从+40mV开始以10mV递减至-120mV的条件电压（Vc）刺激，然后电压钳至+60mV，200ms，测量+60mV时电流峰值，以Vc为-100mV时的电流为1，算出不同Vc下的相对电流（Fractionavailable，FA）.对FA和Vc进行Boltzman拟合：FA-1/{1+exp（V-V0.5）/k，计算出半数失活电压V0.5和斜率k。对照组与HMGB1组电压依赖性失活曲线无明显变化，V0.5分别为-43.25±1.00mV，（n=10）和-42.4±2.13mV，（n=5）P=0.730>0.05。结果表明HMGB1不改变Kv4.3通道电压依赖性失活。 结论： 1. HMGB1剂量依赖性抑制Ito的电流密度，但对通道激活、失活动力学，以及电压依赖性激活和失活无显著影响。 2. HMGB1延长动作电位时程，提示HMGB1具有引起心律失常的潜在威胁。 3. sRAGE减少但并不能完全消除HMGB1对Ito电流的抑制，说明HMGB1至少部分通过RAGE受体发挥对Ito电流的调节作用。 4. HMGB1显著减少Kv4.2和Kv4.3蛋白的表达量，提示HMGB1抑制Ito的另一重要机制是减少Ito α亚基的表达。 5. HMGB1抑制COS-7细胞表达的Kv4.3通道电流，进一步证实HMGB1可直接作用于Ito通道的α亚基发挥作用。