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兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的一种以全身实质器官出血为主要特征的急性、败血性、高度接触传染性、致死性的兔病。RHDV属杯状病毒科兔病毒属,无囊膜,为20面体对称结构,直径40 nm,结构简单。RHDV仅有一个主要结构蛋白VP60,可自我组装成病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs).有研究证实这种病毒样颗粒也可嵌合表达外源基因,或作为疫苗载体。为探究兔出血症病毒样颗粒(VP60-VLPs)是否有作为外源表位载体的能力,本文利用双串联的OVA257-264CD8+T细胞表位(序列为SIINFEKL,以柔性氨基酸GS连接)对RHDV VP60的不同位点进行插入和取代,研究其对嵌合蛋白的表达和病毒样颗粒组装的影响,并通过电镜观察和动物实验,研究VP60 VLPs作为外源片段展示载体的可行性和耐受性。实验过程如下：1.重组穿梭载体的构建 通过运用基因克隆和重组技术将双串联OVA CD8+T细胞表位(GSSIINFEKLGSSIINFEKLGS)插入或取代RHDV VP60的不同位点,将构建的重组目的基因克隆入pMD19-T载体,通过EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切鉴定,回收目的片段并将含有粘性末端的片段连接至真核表达载体pFastBacTM1,再次双酶切鉴定并将阳性菌送公司测序,测序正确的阳性重组质粒转化至DH10Bac菌,蓝白斑纯化三次,挑取白斑提取重组穿梭质粒,分别命名为Bacmid-DN1、Bacmid-DN2和Bacmid-DC。2.三种嵌合蛋白的表达及鉴定 将提取的重组穿梭质粒进行PCR鉴定,通过脂质体转染Sf9细胞。细胞发生明显病变后即可收获重组杆状病毒rBac-DN1、rBac-DN2和rBac-DC,表达嵌合蛋白分别命名为DN1、DN2和DC并通过RT-PCR、血凝实验、间接免疫荧光、SDS-PAGE和Western blot等方法进行鉴定。结果表明,本实验成功表达三种嵌合蛋白,且这三种嵌合蛋白均具有血凝性和反应原性。3.嵌合蛋白的自聚能力和免疫原性研究 通过电镜观察3种嵌合蛋白形成病毒样颗粒的能力,结果显示,在VP60的2-13位和302-309位氨基酸进行替换或插入外源表位后,3种嵌合蛋白仍能形成大小约为40nm的病毒样颗粒。将初步纯化的浓度为40ug/200ul(PBS稀释)的3种嵌合蛋白(DN1、DN2和DC)通过腹腔注射接种7～8周龄C57BL/6雌性小鼠,分别设VP60和PBS为对照组,每组随机选取10只小鼠。免疫三次,每次间隔两周。通过间接ELISA测定小鼠血清中抗嵌合蛋白载体VP60的特异性抗体效价水平；通过ELISPOT试剂盒测定IFN-γ的分泌情况。结果显示,3种嵌合蛋白(DN1、DN2和DC)均可诱导小鼠产生抗载体VP60的体液免疫应答,且三组诱导产生的抗体效价无显著差异性；此外,嵌合蛋白组均能诱导特异性IFN-γ的分泌,其中DN1组和DN2组所引发的细胞免疫应答水平明显高于DC组。本文构建了3种携带双串联鸡源卵清蛋白OVA CD8+T细胞表位(GSSIINFEKLGSSIINFEKLGS,由柔性氨基酸GS相连)的嵌合蛋白。其中DN1为双串联的OVA CD8+T细胞表位插入VP60的N端；DN2为VP60 N端2～13位氨基酸被双串联T细胞表位所取代；DC为VP60 302-309位氨基酸被双串联T细胞表位取代。本实验结果表明,三种嵌合蛋白均可形成与天然病毒样颗粒类似的VLPs,且可诱导不同程度的VP60特异性体液免疫反应和T细胞表位特异性细胞免疫应答。该研究为嵌合VP60 VLPs的形成、结构功能的研究奠定基础,同时扩展了VP60作为载体可携带的外源基因耐受性的研究资料,为后期评价VP60-VLPs展示系统提供了理论依据。