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目的:赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)是一种由纯绿青霉(Penicillium verrucosum)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)和碳黑曲霉(A.carbonarius)产生的在自然界中广泛存在的真菌毒素。研究发现,小麦、玉米等粮食作物及其制品中OTA的污染情况相当普遍,当人和动物食用了被OTA污染的食物和饲料后,其血液、胆汁、尿液、乳汁中均可检测到OTA的残留物。目前已经有研究发现OTA具有肝毒性、肾毒性、免疫毒性、神经毒性、致畸性、致突变性和致癌性等生物学效应。1993年OTA被国际癌症研究中心列为“人类可能的致癌物”。2006年,我们实验室对河北省中南部太行山区食管癌和胃癌高发区磁县和赞皇县居民粮食中OTA的污染状况进行调查,结果发现两地居民食用的小麦中OTA的检出率为37.70 % ,其中OTA的最低含量为0.23μg/kg,最高含量达到14.25μg/kg,均明显高于世界卫生组织/粮农组织联合专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA)暂定的每周容许摄入量100 ng/kg。鉴于OTA在食管癌、胃癌高发区粮食中的高污染情况以及人类的可能致癌性,探讨OTA与当地居民食管癌、胃癌的发生的可能关系对胃癌防治具有非常重要的意义。DNA是机体生命活动最重要的遗传物质,染色体是遗传物质的载体,是由一条双螺旋结构的DNA链与组蛋白结合而成的。DNA是致癌性物质攻击的主要靶分子,致癌性物质能够直接或间接损伤DNA,从而使DNA在复制过程中发生DNA核苷酸序列永久性的改变,进而导致染色体发生断裂,从而使肿瘤更加易于形成。但是目前有关OTA对人胃黏膜上皮细胞和食管黏膜上皮细胞DNA和染色体影响的研究在国内外均未见报道。本研究拟用永生化人正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)和人正常食管黏膜上皮细胞(Het-1A)作为研究对象,应用染色体核型分析技术和单细胞凝胶电泳实验从细胞水平上检测OTA对GES-1细胞和Het-1A细胞染色体及DNA的损伤情况。以期揭示OTA暴露与人胃黏膜和食管黏膜的损伤乃至胃癌、食管癌发生的关系,这对于提高我国农村居民,特别是胃癌、食管癌高发区居民食品的卫生安全具有重要意义。方法:1细胞培养及处理正常人胃黏膜上皮细胞株GES-1、人食管黏膜上皮细胞株Het-1A细胞株培养,传代24 h后选择对数生长期的细胞,随机分为溶剂对照组和OTA处理组。OTA处理组分别予以终浓度为2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L及20μmol/L处理24 h;10μmol/L OTA分别作用6 h、12 h、24 h和36 h,于实验处理相应的时间后收集细胞进行相关指标检测。2单细胞凝胶电泳实验检测DNA的损伤情况2.1采用单细胞凝胶电泳实验检测OTA(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)作用GES-1细胞和Het-1A细胞24 h后Tail DNA%、Tail Length、Olive Tail Moment的变化情况。2.2采用单细胞凝胶电泳实验检测10μmol/L OTA分别处理GES-1细胞和Het-1A细胞6 h、12 h、24 h、36 h后Tail DNA%、Tail Length、Olive Tail Moment的变化情况。3染色体核型分析实验观察细胞染色体畸变情况3.1利用染色体核型分析观察OTA作用于GES-1细胞(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)以及Het-1A细胞(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)24 h后染色体发生的变化情况。3.2利用染色体核型分析观察10μmol/L OTA分别处理GES-1细胞和Het-1A细胞6 h、12 h、24 h、36 h后细胞染色体结构和数目的变化情况。结果:1 OTA对GES-1细胞DNA的损伤作用1.1不同浓度OTA对GES-1细胞DNA的损伤作用单细胞凝胶电泳实验结果显示,不同浓度OTA处理GES-1细胞24 h后,各处理组的彗星率均显著高于溶剂对照组(P<0.05),且在2.5~20μmol/L范围内随处理浓度的增加,彗星率明显增加,呈显著剂量依赖关系(r=0.954, P<0.05)。进一步对溶剂对照组以及OTA处理组细胞在彗星Tail DNA%、Tail Length及Olive Tail Moment三个指标间的差异进行分析。与溶剂对照组比较,各OTA处理组GES-1细胞的彗星Tail DNA%值均高于溶剂对照组(P<0.05),且随着OTA浓度升高其值亦相应增加,呈明显剂量依赖关系(r=0.887, P<0.05)。此外,Tail Length以及Olive Tail Moment变化与Tail DNA值变化相一致,均表现为明显剂量依赖关系(Tail Length:r=0.912, P<0.05;Olive Tail Moment值:r=0.942, P<0.05)。1.2 10μmol/L OTA处理不同时间对GES-1细胞DNA的损伤作用10μmol/L OTA处理6~36 h后,各处理组的彗星率均显著高于溶剂对照组(P<0.05),且彗星率随处理时间延长而明显增高(r=0.977, P<0.05)。同时观察彗星Tail DNA%、Tail Length以及Olive Tail Moment的值发现均分别高于溶剂对照组(P<0.05),且随着处理时间的延长上述指标明增加显著,存在明显的时间依赖性关系(Tail DNA%:r=0.936, P<0.05;Tail Length:r=0.955, P<0.05;Olive Tail Moment:r=0.976, P<0.05)。2 OTA对Het-1A细胞DNA的损伤作用2.1不同浓度OTA处理对Het-1A细胞DNA的损伤作用单细胞凝胶电泳实验结果显示,Het-1A细胞经不同浓度的OTA处理24 h后,各处理组的彗星率均明显高于溶剂对照组(P<0.05),且随OTA浓度升高,彗星率也相应增加,呈明显剂量依赖关系(r=0.968, P<0.05)。接下来观察并分析彗星Tail DNA%、Tail Length及Olive Tail Moment发现,以上三个指标的值均显著高于溶剂对照组(P<0.05),且在2.5~20μmol/L范围内,随着OTA浓度升高而相应增加,呈明显的剂量依赖关系(Tail DNA%值:r=0.909, P<0.05;Tail Length:r=0.887, P<0.05;Olive Tail Moment:r=0.995, P<0.05)2.2 10μmol/L OTA处理不同时间对Het-1A细胞DNA的损伤作用10μmol/L OTA处理6~36 h后,各处理组的彗星率均显著高于溶剂对照组(P<0.05),且随处理时间的延长,彗星率明显增加,存在明显时间依赖关系(r=0.937, P<0.05)。同时对彗星Tail DNA%、Tail Length及Olive Tail Moment进行统计分析,发现在6~36 h内,随着OTA作用时间的延长,以上三个指标的值均相应增加,呈明显的时间依赖关系(Tail DNA%值:r=0.959, P<0.05;Tail Length:r=0.977, P<0.05;Olive Tail Moment:r=0.968, P<0.05)3 OTA对GES-1细胞染色体核型的影响3.1不同浓度OTA对GES-1细胞染色体核型的影响染色体核型分析表明,2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L OTA分别处理GES-1细胞24 h,染色体结构异常和数目异常的发生率增加,其中10μmol/L OTA处理组染色体畸变率明显高于溶剂对照组(P<0.05)。3.2 10μmol/L OTA处理GES-1细胞染色体核型的影响10μmol/L OTA分别处理6 h、12 h、24 h及36 h,细胞染色体结构异常和数目异常的发生率增加,其中12 h、24 h和36 h组染色体畸变率明显高于溶剂对照组(P<0.05)。4 OTA对Het-1A细胞染色体核型的影响4.1不同浓度OTA处理Het-1A细胞染色体核型的影响染色体核型分析结果示,2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L OTA处理后染色体畸变率分别为9.00%、9.00%、10.00%、15.00%,均明显高于溶剂对照组(2.00%,P<0.05)。4.2 10μmol/L OTA处理不同时间Het-1A细胞染色体核型的影响10μmol/L OTA分别作用Het-1A细胞6 h、12 h、24 h、36 h后,细胞染色体结构异常和数目异常发生率增加,其中12 h、24 h和36 h组染色体畸变率均较溶剂对照组明显升高(P<0.05)。5 OTA对GES-1细胞和Het-1A细胞DNA及染色体的损伤的比较不同浓度(2.5~20μmol/L)、不同时间(6~36 h)OTA作用于GES-1细胞和Het-1A细胞后,DNA损伤指标包括彗星的发生率、Tail DNA%、Tail Length、Olive Tail Moment均明显增加,OTA诱导的这两株细胞的DNA损伤无明显差异。OTA剂量达到10μmol/L方可诱导GES-1细胞的染色体发生显著畸变,但OTA剂量为2.5μmol/L和5μmol/L时即能引起Het-1A细胞染色体发生显著畸变,提示Het-1A细胞对低浓度OTA较GES-1细胞更为敏感。结论:1 OTA可以剂量及时间依赖性地诱导GES-1细胞和Het-1A细胞DNA损伤,其彗星率、彗星Tail DNA%、Tail Length、Olive Tail Moment值均较溶剂对照组明显增高。2 OTA可以诱导GES-1细胞和Het-1A细胞染色体发生结构异常(双着丝粒、断裂、空隙、环)和数目异常(多倍体)。3 OTA引起的GES-1细胞和Het-1A细胞的DNA损伤情况无明显差异;低浓度OTA即可引起Het-1A细胞染色体发生明显畸变,较GES-1细胞更加敏感。