目的：MicroRNA (miRNA)由内源性小非编码RNA基因产生,长度约为22nt。研究表明,大约1/3人类基因为保守的miRNA的调控靶标。MiRNA通过保守的互补性种子区域(2-7个核苷酸)识别mRNAs。MiRNA在细胞生物进程中具有重要作用,包括细胞自我更新、细胞分化、细胞生长和细胞死亡等,而这些进程在癌症发生机制中都表达失调。越来越多的研究结果表明miRNAs表达异常与癌症的发病具有相关性。许多miRNAs在乳腺癌中表达失调(包括表达增高或表达降低)。因为每一个miRNA可能的靶向调控基因数量达到人类基因组的1/3,而mRNAs可以由多个miRNA靶向调控,所以我们完全有理由认为大量的miRNAs靶向调控基因还未完全被我们所了解。乳腺癌是一种高度异质性疾病,这种异质性不仅表现在临床上和组织学分型上,还表现在基因表达谱上。隐藏在这种异质性之下的是分子谱系的改变和疾病发病机制的不同。根据基因表达谱,乳腺癌可分为5种分子亚型,即：基底样乳腺癌(basal-like breast carcinoma),管腔A型(luminal A),管腔B型(lumina1 B), HER-2过表达型(HER-2over-expressing)和正常乳腺样乳腺癌(normal breast-like breast carcinomas)。与管腔A型和管腔B型及正常乳腺样乳腺癌表型相比较,基底样乳腺癌亚型和HER-2过表达亚型具有更加侵袭性的临床行为。尽管最新的研究表明,一些miRNAs在乳腺癌中表达失调,如miR-205/200c/10b,然而就我们所知,miRNAs表达失调和包括靶基因在内的相关的生物学过程仍然未能完全被我们所了解。考虑到miRNAs的潜在作用,我们仍然还需要进行大量的实验研究,实验研究的最终目的是使得我们完全了解miRNAs的作用和功能。材料和方法：乳腺癌病人的标本和其正常对照组标本收集于南京大学医学院临床学院／南京军区总医院病理科(2009年1月-2010年1月),标本收集按照南京军区总医院道德伦理委员会关于人体标本使用的协议进行。新鲜乳腺癌组织和同一病人的正常对照乳腺组织皆在乳腺癌术后1小时内收集,收集的标本立刻冻存于-80℃冰箱以防止RNA降解。基底样乳腺癌的鉴别采用免疫组织化学和荧光原位杂交方法。基底样乳腺癌的诊断标准采用Nielsen等建议的方法,诊断所使用的抗体主要为ER、PR、HER-2、CK5/6、CK14、P63、EGFR、P53和Ki-67。光镜下观察免疫组化染色切片5个具有代表性的高倍视野,分别计数200个细胞,按阳性细胞所占比例分为阴性(-),弱阳性(+；0-25%),中等阳性(++；25-50%)和强阳性(+++;>50%)。HER-2细胞膜阳性且评分为3时才可被认为HER-2阳性。EGFR阳性部位为胞膜,CK5/6和CK14阳性部位为胞浆,ER、PR, P63. P53和Ki-67的阳性部位为胞核。每次试验均设阳性对照和阴性对照。HER2基因扩增检测采用FISH方法。HER-2基因探针位于17号染色体17q11.2-q12,对照探针CEN位于17号染色体17p11.1-q11.1。每一张组织切片计数30个肿瘤细胞核红色HER2信号和绿色CEN17信号。计算HER2/CEN17比值。如果HER2/CEN-17比值>2.2则认为HER2基因扩增。如果比值<1.8则认为无HER2基因扩增。如果比值介于1.8和2.2之间,增加计算30个细胞核红色HER2信号和绿色CEN17信号并重新计算HER2/CEN17比值。提取组织总RNA。MiRNA在基底样乳腺癌中的表达采用Exiqon miPCURYTM LNA microRNA高通量：芯片进行检测,使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度,并将实验结果转换成数字型数据保存,计算肿瘤与阴性对照组之间miRNA表达量的差异(T/N),对检测结果进行等级聚类分析,从中发现具有差异性表达的miRNA。通过QRT-PCR实验对Exiqon miPCURYTM LNA microRNA高通量芯片检测结果进行验证。为了验证扩增的特异性,扩增反应完成后进行热变性,以产生溶解曲线。所有的反应都重复3次。以GAPDH作为QRT-PCR实验的内参。MiRNA在基底样乳腺癌与正常对照之间的差异分析,采用2-ΔCT相对定量法。对QRT-PCR的扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。对基底样乳腺癌和其正常对照之间具有差异表达的上调组miRNA-106b、 mi-RNA141、miRNA-200c和下调组miRNA-129-5p、miRNA-205、miRNA-451的靶基因进行生物信息学预测分析。预测分析采用采用one-side Fisher’s精确检验和,检验统计方法进行Gene Ontology (GO)分类。同时,我们在研究中,将Affymetrix探针的ID号和Entrez gene的ID号互相匹配,并使用U133A的注释对其进行诠释。随后,按照miRNA的“度”,建立具有正性／负性调控碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢过程(positive/negative regulation of nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolic process)的生物学过程相关的miRNA-mRNA相互作用的调控网络。运用免疫组化方法对KLF12蛋白在基底样乳腺癌中的表达进行定性和定位研究。运用Western blot方法对KLF12蛋白在基底样乳腺癌中的表达进行定量研究。两组之间的均数差异采用A Student’s t-test统计方法进行比较,ANOVA统计方法用于多重比较。当P-value< 0.05时,差异具有统计学意义；当P-value<0.01,差异具有显著统计学意义。结果：通过免疫组化和荧光原位杂交方法,筛选出18例基底样乳腺癌用于miRNA芯片分析和miRNA QRT-PCR验证。MiRNAs基因芯片结果显示,在基底样乳腺癌中,上调组miRNAs为11个,下调组miRNAs为18个。与正常乳腺组织相比较,miR-106b(P<0.01), miR-141 (P<0.05)和miR-200c (P< 0.01)在基底样乳腺癌中的表达显著增加。与之相反,与正常乳腺组织相比较,miR-129-5p (P< 0.05), miR-205 (P< 0.05)和miR-451(P<0.05)在基底样乳腺癌中的表达显著减少。QRT-PCR实验结果与miRNA芯片表达谱的实验结果相符合。通过生物信息分析研究,结果显示高表达miRNAs靶向调控的具有显著差异的GOs为“负性调控碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢过程”,“正性调控RNA聚合酶Ⅰ启动子转录”和“转录子激活”等生物学过程。与之相反,通过生物信息分析研究,结果显示低表达miRNAs靶向调控的具有显著差异的GOs为“正性调控碱基、核苷、核昔酸和核酸代谢过程”,“正性调控骨髓细胞分化”,“转录调控”等生物学过程。高表达组和低表达组miRNA最为具有显著差异的GOs为“正性／负性调控碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢过程”生物学过程。在基底样乳腺癌中3个高表达的miRNAs (miR-106b, miR-141 and miR-200c)的最为靶向调控的mRNAs的“度”为3 (degree 3),而在基底样乳腺癌中低表达的3个miRNAs中,miR-205和miR-129-5p最为靶向调控的mRNAs的“度”为2 (degree 2), miR-451靶向调控的mRNAs的“度”为0。所有三个上调组miRNA都靶向调控KLF12基因,而下调组miRNA中,仅miR-205靶向调控KLF12基因。因此在上调和下调miRNA-mRNA调控网络中,KLF12的“度”为4。最为可能的靶向调控基因为KLF12。免疫组化结果显示,在正常对照乳腺组织中,KLF12蛋白表达为阴性；而在基底样乳腺癌组织中,KLF12蛋白呈弥漫性细胞核阳性表达。Western bolt结果显示,与正常对照乳腺组织相比较,KLF12蛋白在基底样乳腺癌中的表达显著增高。结论：上调组miR-106b/141/200c和下调组miR-129-5p/205/451表达失调在基底样乳腺癌中是一个经常性的事件。MiR-106b/141/200c/205表达变化可通过“正性/负性调控碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢过程”这一生物学过程靶向调控KLF12基因。MiR-106b/141/200c和其靶向调控基因KLF12在基底样乳腺癌中可能为潜在的原癌基因而,而miR-205在基底样乳腺癌中可能为潜在的抑癌基因。MiR-106b/141/200c/205和其靶基因KLF12通过促进增殖和分化从而在基底样乳腺癌的发病机制中具有重要作用。MiR-106b/141/200c/205和KLF12在基底样乳腺癌中可作为诊断标记物和潜在的治疗靶标。