大肠杆菌是临床感染常见的病原体,抗生素是治疗的最主要方式,然而近些年来大量文献报道关于大肠杆菌多重耐药性的出现,导致治疗失败或疗效减弱,严重影响畜牧生产的发展及人和动物的身体健康。细菌产酶机制是细菌耐药的主要原因,其中产超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum β-Lactamases,ESBLs)是细菌介导对青霉素类、窄谱和广谱头孢菌素类、单环内酰胺类、氨基糖苷类抗生素耐药的主要原因。产ESBLs菌株常见于大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、不动杆菌属等。ESBLs耐药基因主要通过质粒介导、转座机制、整合子-基因盒系统等方式水平转移,导致其耐药性的高水平表达及其广泛分布。本文主要目的分析不同年代大肠杆菌耐药性变化趋势,了解产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌(ESBLs-producing Escherichia coli,ESBL-EC)流行现状,分析临床分离产 ESBL-EC 耐药表型和基因型特征。此外对于常见的水平元件进行检测,为临床产ESBLs大肠杆菌的流行病学调查与防控提供数据支持。其主要内容如下:1.大肠杆菌耐药性分析不同年代收集保存的猪源和鸡源为主的大肠杆菌共计467株,对其进行K-B法药敏试验。K-B法药敏试验显示主要对于AMP、KZ、TE等表现耐药,耐药率分别为44.2%、47.6%、59.3%。部分菌株呈现多重耐药现象,50年代至2000年,AMP、SXT、TE、FOS、NOR、CN等多种药物的耐药率逐渐提高,2010-2018年间分离菌株耐药性分析显示AMP、SXT、TE、FOS、NOR、CN 耐药率分别达到 73.1%,57.7%,78.8%,9.6%,48.1%,40.4%。2.产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌的检测及其耐药性分析利用3种不同的方法(双纸片表型确证法、VITEK Compact2.0、显色培养基)检测ESBL-EC,最终确证16株ESBL-EC,均来自2017-2018年临床分离的49株大肠杆菌,检出率为 32.7%(16/49)。16 株 ESBL-EC 主要表现对 AMP(100%)、KZ(93.8%)、FEP(75%)、CTX(100%)、TE(93.8%)、LEV(75%)、SXT(81.3%)、CL(62.5%)、NOR(75%)等多种药物表现高水平耐药。对于常见的产超广谱酶基因进行检测,结果显示16株ESBL-EC 主要是 CTX-M-1 群基因(blaa CTX-M-1,bla CTX-M-28,bla CTX-M-69,bla CTX-M-79)和CTX-M-9 群基因(bla CTX-M-14,blaCTX-M-27,bla CTX-M-65)及嵌合基因 bla CTX-M-132,另外分离到一株SHV-108型ESBL-EC。此外还检测到1 1株菌同时携带TEM-1型β-内酰胺酶(68.8%)。通过分析临床分离产ESBL-EC耐药表型和基因型,从而了解产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌流行现状。3.16株产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌的分型利用常见的分型手段MLST分型、ERIC分型、系统进化分群比较分析菌株的流行特征。系统进化分群结果显示16株ESBL-EC中A群8株(50%)、B1群5株(31.3%)、B2群1株(6.3%)及D群2株(12.5%)。大肠杆菌ERIC分型结果则将这些菌株分为G1-G5共5个组。MLST分型结果显示其中14株ESBL-EC菌株共分为7个ST型,分别为ST2、ST21、ST43、ST53、ST132、ST471、ST479,而有2株菌无法判断ST型。不同分型方式对ESBL-EC进行分型为其流行预测提供数据支持。4.ESBL-EC多重耐药水平转移原件检测通过PCR对常见的整合子-耐药盒、插入序列等水平转移元件进行检测。整合酶检测结果显示15株菌检测到Ⅰ型整合酶(93.8%),而未检测到Ⅱ型整合酶。对于整合酶阳性菌株进行整合子可变区的扩增,有11株菌扩增出整合子,共扩增出3种大小的目的片段727bp、1580bp、3000bp,分别携带 drfA25,dfrA17、aadA5 以及 aacA4、cmlA1 耐药基因。插入序列检测结果显示,14株菌检出插入序列ISECP1(14/16),9株菌检出ISCR1(9/16),1株菌检出IS26(1/16)。其中有6株同时检出ISECP1和ISCR1(6/16),有1株同时检出ISECP1和IS26(1/16)。通过对CTX-M-9群的6株ESBL-EC分别与C600菌株进行质粒接合实验,获得4株接合子(Con1374、Con1376、Con1390-2、Con1393),接合子通过接合性质粒获得AMP、KZ、CTX、TE等多种药物的抗性。对于常见的水平元件进行检测,有助于临床产ESBLs大肠杆菌的耐药性转移分析。