研究背景胰岛移植重建胰岛素分泌系统，是一种有望彻底根治糖尿病的治疗方法。2000年，Edmonton方案的成功，标志着胰岛移植取得了突破性的进展，从而带动了胰岛移植临床试验性治疗在世界范围内广泛展开。但是免疫排斥以及免疫抑制剂所带来的副作用和潜在危险性仍是难以克服的障碍。目前普遍认为，解决异体移植排斥反应的关键在于诱导受体对供体的细胞、组织或器官产生免疫耐受。由于移植免疫耐受的机制十分复杂，尽管诱导免疫耐受的方法众多，但均未能达到完全可靠持久的特异性耐受。细胞凋亡是生物体内普遍存在的一种生理和病理现象，是正常器官和组织发育、清除有害的、过量的和无功能细胞、维持自身稳态的必要环节。现有研究表明：凋亡是机体免疫状态保持平衡和稳定的重要作用机制，凋亡细胞对免疫系统存在着主动的调节作用。凋亡细胞能分泌脂类趋化因子，改变自身胞膜结构表达“eat-me”信号，诱导吞噬细胞对其进行清除；同时凋亡细胞被抗原提呈细胞吞噬后，通过吞噬细胞分泌抑制性免疫因子如TGF-β、PGE₂、IL-10等，造成了特殊的抗原识别微环境，可以促使相关淋巴细胞针对凋亡抗原产生免疫耐受，而不会引起炎性免疫应答。据此，孙尔维等提出利用供体凋亡细胞输注受体诱导供体特异性免疫耐受的理论设想。我们课题组以前的工作证实，凋亡细胞在体外对T淋巴细胞活化增殖有直接抑制作用；凋亡细胞预输注可以显著延长大鼠心脏移植模型、肝移植模型存活时间。因此，我们拟应用糖尿病大鼠模型进行同种异体胰岛移植，以供体凋亡脾淋巴细胞静脉输注的方法，观察胰岛移植物的存活时间，了解凋亡细胞调节免疫反应过程参与的淋巴细胞类型、细胞因子及分子基础，探求延长胰岛移植物存活的方法。目的初步探讨凋亡细胞静脉输注诱导胰岛移植免疫耐受的方法及作用机制，为寻找诱导胰岛移植免疫耐受的方法开辟新的途径，提供新的依据。方法1、直线加速器照射对体外培养大鼠脾细胞凋亡的影响：采用研磨法获得Wistar大鼠脾淋巴细胞悬液。将脾细胞悬液加入细胞培养瓶，分四组，A组为对照组，B、C、D组应用Varian医用直线加速器照射，各组吸收剂量分别为：1.5Gy、2.0Gy、3.0Gy。各组细胞处理后置于37℃，5％CO₂恒温培养箱培养。分别在培养后4h、8h、12h应用流式细胞仪检测细胞凋亡率；2、大鼠胰岛细胞的分离纯化：采用胶原酶P胰管灌注消化，短期低温培养后Ficoll-400不连续梯度纯化Wistar大鼠胰岛；3、建立糖尿病动物模型：以STZ（56mg／kg·体重）经腹腔一次性注射，制备SD大鼠实验性糖尿病模型（连续2次血糖＞16.7mmol／L）：4、供体凋亡细胞输注对糖尿病胰岛移植物的影响：以雄性Wistar大鼠为供体，雄性SD大鼠为受体。将糖尿病SD大鼠随机分为Hank’s液注射（A组）、正常供体脾细胞预输注（B组）、供体凋亡脾细胞预输注（C组）及供体坏死脾细胞预输注（D组）四组。各组在预处理7天后行胰岛移植，将1000IEQ的胰岛细胞移植入各组糖尿病大鼠的肾包囊内，比较各组移植物生存时间上的差异。同时各实验组分别在预处理后第7天（即胰岛移植术前）、胰岛移植术后7天、14天、排斥后应用放射免疫法测定大鼠血清胰岛素水平。供体凋亡脾细胞预输注糖尿病SD大鼠则在不同的移植时期（包含血糖正常期、排斥期两个时期）手术将移植物载体肾取出；其余各实验组在糖尿病SD大鼠移植物排斥后2天，取出其移植物载体肾，做胰岛素的免疫组化检测。5、供体凋亡细胞输注对胰岛移植糖尿病大鼠混合淋巴细胞反应的影响：将糖尿病SD大鼠按上述方法分组，各组分别于预处理后第7天（即胰岛移植术前）、胰岛移植术后7天、14天、排斥后取大鼠脾脏，分离淋巴细胞，与丝裂霉素C处理的供体Wistar大鼠和无关第三品系F344／N大鼠脾淋巴细胞进行单向混合淋巴细胞培养，MTT法观察受体淋巴细胞增殖反应；6、供体凋亡细胞输注对胰岛移植糖尿病大鼠T淋巴细胞亚群及CD4⁺CD25⁺T细胞的影响：将糖尿病SD大鼠按上述方法分组，各组分别于预处理后第7天（即胰岛移植术前）、胰岛移植术后7天、14天、排斥后取外周血及大鼠脾脏制备的淋巴细胞悬液，应用流式细胞仪检测CD8⁺、CD4⁺、CD4⁺CD25⁺／CD4⁺T淋巴细胞比率。7、供体凋亡细胞输注对胰岛移植糖尿病大鼠细胞因子微环境的影响：将糖尿病SD大鼠按上述方法分组，各组分别于预处理后第7天（即胰岛移植术前）、胰岛移植术后7天、14天、排斥后取外周血清及大鼠脾组织标本，应用Luminex多功能流式点阵仪液相芯片法检测IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10含量；同时应用酶联免疫吸附法检测外周血清TGF-β1含量。结果1、直线加速器高能X线照射Wistar大鼠脾细胞，吸收剂量1.5Gy组于4h后开始有明显细胞凋亡发生，而后随时间推移凋亡率增加。2.0Gy组于4h后即有显著凋亡发生，至8h达到凋亡高峰（61.17±3.70）％（P＜0.050），但于12h凋亡率略有下降。3.0Gy组凋亡率无显著升高，而坏死率明显增加。2、每条Wistar大鼠胰腺经分离、纯化后平均可获取的胰岛细胞团数量为（1063.91±84.74）IEQ，DTZ染色显示纯度为（70.51±6.20）％。高糖刺激时胰岛B细胞胰岛素的释放量为低糖刺激时的2.72倍；3、以STZ（120mg／kg·体重）一次性经腹腔注射的方法，可成功诱发SD大鼠的试验性糖尿病，糖尿病模型建模成功率为94％；4、供体凋亡脾细胞预输注组糖尿病SD大鼠胰岛移植物生存时间与其它三组比较具有显著性差异（P＜0.050），中位生存时间（MST）为（31.00±6.41）天，最长达42天。正常脾细胞输注组移植物生存时间也有所延长，MST为（12.00±2.97）天（P＜0.050）。预输注Hank’s液及坏死细胞组则无此效应，MST分别为（6.00±1.67）、（6.00±1.10）天；5、供体预输注凋亡脾细胞组移植后7天、14天糖尿病大鼠血清胰岛素水平较移植前显著增高，分别达（19.26±4.50）mIU／ml、（20.70±6.33）mIU／ml（P＜0.050），排斥后胰岛素水平回落。正常细胞组移植后7天胰岛素水平亦明显增高（P＜0.050），14天时则明显下降，而预输注Hank’s液及坏死细胞组则无明显变化。6、供体凋亡细胞预输注组胰岛移植物在受体血糖正常时取出做组织切片，经Insulin免疫组织化学染色证实有表达胰岛素阳性的胰岛细胞团存在，呈棕褐色。而在被排斥后取出的移植物进行免疫组化检测，则未发现胰岛素阳性的胰岛细胞团存在。输注Hank’s液组、输注供体正常细胞或坏死细胞组的移植物在被排后取出行Insulin免疫组化染色检测，亦无胰岛素阳性细胞存在。7、供体凋亡细胞预输注后7天SD大鼠的脾细胞对丝裂霉素C处理的Wistar大鼠脾细胞的增殖反应较接受Hank’s液输注组、供体正常脾细胞组及供体坏死脾细胞组明显降低（P＜0.050），直至移植后7天、14天抑制效应仍为显著，排斥后则明显升高（P＜0.050）；且与无关第三品系F344／N大鼠脾细胞的增殖反应比较，两者差异明显，移植前、移植后7、14天各时间点相互比较均有显著性差异（P＜0.050）8、各处理组糖尿病大鼠接受胰岛移植后，无论外周血还是脾脏组织CD4⁺T细胞和CDS⁺T细胞比例均显著升高（P＜0.050），各组间无明显差异（P＞0.050）。9、供体凋亡细胞预输注后7天，糖尿病大鼠外周血和脾脏CD4⁺CD25⁺T细胞比例均明显高于预输注Hank’s液组、供体正常细胞组及供体坏死细胞组，分别占CD4⁺T细胞的（11.49±1.29）％、（12.44±1.63）％（P均＜0.050）；移植后7天、14天仍保持较高比例，排斥后则有所下降。10、胰岛移植前各实验组糖尿病大鼠外周血和脾脏组织IL-2水平均无显著性差异（P＞0.050）。移植后各组均明显升高，但供体凋亡细胞输注组在移植后7天、14天的IL-2水平明显低于Hank’s液输注组、供体正常细胞组及供体坏死细胞组，有显著性差异（P＜0.050）；排斥后明显升高。11、胰岛移植前各实验组糖尿病大鼠外周血和脾脏组织IFN-γ水平亦无显著性差异（P＞0.050）。移植后各组均明显升高，但移植后7天、14天，供体凋亡细胞输注组与Hank’s液输注组、供体正常细胞组及供体坏死细胞组相比水平较低，有显著性差异（P＜0.050）。排斥后则升高显著。12、胰岛移植前各实验组糖尿病大鼠外周血和脾脏组织IL-4水平无显著性差异（P＞0.050）；移植后7天、14天直至排斥后预输注Hank’s液组、供体正常细胞组、供体凋亡细胞组及供体坏死细胞组IL-4水平均无明显改变。13、输注供体凋亡细胞后7天，糖尿病大鼠外周血和脾脏组织IL-10水平显著升高；直至移植后7天、14天仍明显高于其它各组，有显著性差异（P＜0.050）；移植物排斥后则降低。同时，接受Hank’s液预输注组、供体正常细胞组及供体坏死细胞组无明显变化。14、输注供体凋亡细胞后7天，糖尿病大鼠血清TGF-β1水平明显升高，并在胰岛移植后7，14天仍可维持较高水平（P＜0.050）；移植物排斥后TGF-β1水平下降。而其余Hank’s液预输注组、供体正常细胞组及供体坏死细胞组无明显变化。结论1、直线加速器高能X线照射能在体外简便安全有效诱导大鼠脾细胞凋亡。2、采用胶原酶P胰管灌注消化，短期低温培养后Ficoll-400不连续梯度纯化能分离、纯化出较大数量且功能良好的大鼠胰岛细胞。3、预输注供体凋亡细胞能显著延长同种异体大鼠胰岛移植物的存活时间。应用供体凋亡细胞诱导胰岛移植免疫耐受是一条可行的途径。4、以单向混合淋巴细胞培养实验证实，预输注供体凋亡细胞的受体鼠淋巴细胞对供体淋巴细胞刺激的增殖反应具有明显抑制作用。5、供体凋亡细胞预输注能显著升高胰岛移植糖尿病大鼠外周血和脾脏CD4⁺CD25⁺T细胞比例。6、供体凋亡细胞预输注可使胰岛移植糖尿病大鼠血清和脾脏IL-2、IFN-γ呈现较低水平，而显著升高IL-10、TGF-β水平，IL-4则无明显改变，提示供体凋亡细胞输注诱导胰岛移植免疫耐受可能包含调节Th1／Th2、Th3平衡，纠正免疫偏离的作用；并且更为重要的机制可能是，Tr、Tr1等尤其是CD4⁺CD25⁺T调节性淋巴细胞的参与。