多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）是一类由浆细胞克隆性恶性增殖引起的致死性疾病,发病率占所有血液肿瘤的10%。近年来,随着以抗体偶联药物、双特异性抗体和嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）为代表的肿瘤免疫治疗技术的飞速发展,给MM患者带来了新的希望。由于MM遗传和表型的异质性,BCMA（B cell maturation antigen）、CD38、CD138 等靶点都不是由 MM 细胞唯一表达的,且这些靶点会从肿瘤细胞表面裂解或脱落引起肿瘤逃逸,这也是MM复发难治的重要原因。因此,迫切需要筛选结合不同抗原或相同抗原不同表位的抗体并开发成药,以有效避免抗原突变或者丢失引起的药效降低或者耐药,增强药物的长期持久性。GPRC5D（G protein-coupled receptor class C group 5 member D）属于 G 蛋白偶联受体超家族RAIG1（Retinoic acid inducible gene 1）家族成员,不仅可以在细胞膜表面稳定表达,不会脱落,而且在除毛囊以外的正常细胞中不表达,仅在MM细胞中显著上升表达,成为MM治疗的良好靶标。然而由于GPRC5D具有复杂的7次跨膜结构,并且胞外结构域结构较小、难以纯化,严重制约了其抗体的开发。为此,本论文尝试分别以GPRC5D的表达质粒和过表达细胞株为免疫原,结合动物免疫和噬菌体展示技术淘选识别GPRC5D天然表位的特异性抗体,并将其与CD3抗体一起应用于双特异性抗体的构建和功能评价,为MM的免疫治疗研究提供新的思路。论文分别利用过表达人GPRC5D的293T-Hu.GPRC5D细胞和GPRC5D表达质粒pLVX-GPRC5D对Balb/C小鼠进行免疫,并利用流式细胞术（FACS）对免疫后小鼠血清的抗体效价进行检测。结果表明:使用质粒免疫的小鼠血清中没有检测到GPRC5D特异性抗体,而采用细胞免疫的小鼠血清效价达到1:100,000以上,表明该免疫策略可以显著激活小鼠针对GPRC5D的体液免疫应答。随后我们利用细胞免疫后小鼠的脾脏细胞构建了噬菌体抗体库（库容量:1.16×109,克隆阳性率＞95%）,并利用GPRC5D阴性和过表达的293T细胞开展了一轮负向和三轮正向淘选。最终筛选出了近150个结合活性高于阳性对照的抗体克隆,通过测序最终确定了 6条抗体序列。进一步对这些抗体进行表达和纯化后得到5个与NCI-H929细胞结合活性显著高于纪念斯隆凯特琳癌症中心制备的阳性对照抗体（ET150-8BMK）,通过序列同源性分析和比对,我们最终选择xw.HTS0370和xw.HTS0375进行后续的人源化改造。接着,我们将人源化后的抗体与多种正常细胞进行组织交叉反应性检测,结果表明人源化抗体zw.HTS0370Z22和zw.HTS0375Z56与B细胞、T细胞、CD14+单核细胞以及CD11b+细胞均没有结合,具有较高的细胞特异性。相比之下,阳性对照抗体（ET150-8BMK）与CD11b+和CD14+细胞均有一定结合。同时,单抗亲和力测定的结果显示,zw.HTS0375Z56和zw.HTS0370Z22与人GPRC5D蛋白结合亲和力更高。随后,我们利用与人源化抗体不结合的GPRC5A的胞外段分别替换相应的GPRC5D同位置的胞外段,构建一系列含有不同胞外段的GPRC5D突变体细胞系,并将GPRC5D人源化抗体与突变体细胞系进行结合实验,结果显示:人源化抗体zw.HTS0375Z56和zw.HTS0370Z22可能结合在GPRC5D蛋白C末端的ECD3和ECD4胞外结构域,与目前已报道的GPRC5D抗体结合的表位均不相同,且具有更高的肿瘤特异性和亲和力。为深入探究GPRC5D人源化抗体在MM治疗中的应用前景,我们将筛选得到的GPRC5D人源化单抗zw.HTS0370Z22和zw.HTS0375Z56与CD3抗体分别构建成DouBody架构和CrossMab架构的IgG型双特异性抗体。然后,利用ELISA检测双特异性抗体与Virus-Like Particle（VLP）技术制备的GPRC5D蛋白和CD3蛋白的结合活性,结果发现虽然4个抗体与GPRC5D蛋白均有结合,且结合活性好于由强生制药开发的同靶点的已开展临床试验的阳性对照药物GC5B596D,但 CrossMab 架构的 370Z22KC 和 375Z56KC 与 GPRC5D 的结合活性明显优于DuoBody架构的370Z22D和375Z56D。其中375Z56KC与肿瘤细胞株NCI-H929的结合活性最好。375Z56KC双抗与人GPRC5D蛋白结合的单臂亲和力最高,约是强生制药的对照双抗GC5B596单臂亲和力的6倍。随后,我们在外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）和肿瘤细胞的共培养体系中利用LDH释放法对双抗的体外抗肿瘤活性进行了评价,结果显示375Z56KC对肿瘤细胞的杀伤活性最高,且其对于Jurkat-NFAT-luc细胞中NFAT转录活性的激活也最为明显。因此我们选择375Z56KC来开展后续的体内动物实验。首先我们将2× 106/只的NCI-H929细胞接种到小鼠皮下,接种1天后将2×106/只的健康人PBMC注射到小鼠体内,并在肿瘤生长至100mm3的时候将双抗按照1.5μg/只/次或6μg/只/次的剂量（每周注射2次,共5次）注射到小鼠体内。结果表明相比对照组小鼠,阳性对照组GC5B596D和375Z56KC组均能够显著抑制肿瘤的生长,而375Z56KC对肿瘤的抑制效果显著高于阳性对照组,仅使用1.5μg/只/次的剂量就可以完全抑制肿瘤的生长,同时375Z56KC双抗治疗组中总的T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞占比以及小鼠血清中IFN-γ的含量均显著高于空白和阳性对照组。进一步,我们对肿瘤组织进行免疫荧光分析后发现:375Z56KC双抗治疗后肿瘤组织中的CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量确实显著提高,和流式的分析结果一致,表明375Z56KC双抗具有较好的抗肿瘤免疫治疗效果。同时,通过小鼠重要脏器的HE染色分析后发现,无论是阳性对照组还是375Z56KC双抗治疗组的脏器均未出现明显损伤。最后,我们利用带有Luciferase报告基因的MM.1S细胞进行小鼠体内杀伤实验,在24 μg/只/次（每周2次,共6次）的抗体剂量下,375Z56KC双抗能够显著抑制MM.1S在小鼠体内的生长,显著优于阳性对照组375Z56KC的肿瘤治疗效果,以上结果表明我们构建的375Z56KC双抗在体内外都有较好的结合活性,并且在体内通过激活T细胞免疫对多种MM细胞株起到杀伤作用。双特异性抗体在临床治疗中所取得的巨大突破,使其迅速成为肿瘤免疫治疗领域的研究热点。论文利用基于细胞免疫和噬菌体展示抗体库的细胞淘选技术,筛选得到了一个全新表位的GPRC5D特异性单克隆抗体,在对其进行人源化的基础之上,将其与CD3特异性抗体结合,构建了具有不同结构特征的双特异性抗体,并进行全面的体内外抗肿瘤功能评价。结果表明:论文构建的双特性抗体375Z56KC不仅在体内外均具有良好的抗肿瘤作用,还能够有效提高T细胞介导的抗肿瘤免疫应答,并且其效果显著优于强生制药开发的已经进入临床Ⅱ期的GPRC5D双抗Talquetamab（GC5B596D）,具有非常大的临床应用前景和转化价值,论文的研究为MM的肿瘤免疫治疗提供了新的工具和新的思路。