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研究背景:
子痫前期(PE)是特发于妊娠期女性的一类严重并发症，为现今导致围产期母儿死亡的一大因素，对母婴健康存在极大威胁。其在世界范围内的发病率达2～8％左右，我国的发病率更高，为9.4％。临床上以孕20周以后出现的高血压伴发母体相关综合征(如蛋白尿，肝肾等多脏器功能异常)及胎儿综合征(胎儿生长受限及或羊水过少)为主要表现。根据发病孕周，存在早发型PE(＜34w)以及晚发型PE(≥34w)之分。前者通常进展迅速，发生重度母婴不良并发症的几率更高[4]，严重时可导致胎死宫内、胎盘早剥等不良结局。针对PE，临床通用的监测手段仅为镇静、解痉、降压、纠正低蛋白血症等对症治疗，明确的干预方案依然是终止妊娠，与此同时，引发了诸多相关近远期并发症，诸如早产等。因此能够尽早预测子痫前期的发病，做到尽早预防，有效干预和治疗十分重要。子痫前期发病机制复杂，尚未完全明确，多阶段发展、多病因、多机制的复杂病理过程，现今一致认可的观点是“滋养细胞浸润功能损伤，子宫螺旋动脉无法正常重塑，致胎盘浅着床”[5]。该学说认为，子痫前期患者胎盘形成的早期，滋养细胞增殖和分化异常，凋亡加剧，活性下降，使滋养细胞侵袭活性减弱，无法正常侵入子宫肌壁，由此子宫螺旋小动脉无法正常重塑导致胎盘浅着床，胎盘缺血，由此引发PE。而其发生机制之一是滋养细胞缺血缺氧导致的氧化应激反应。
KISS1基因是学者Lee等[6]于1996年借助消减杂交(SH)与差异显示技术(DD-PCR)揭示人黑色素瘤细胞株相应转移活性时率先发现的，位于1号染色体长臂1q32-q41区，是提取自非转移性恶性黑色素瘤的一类肿瘤转移抑制基因(MSG)[7，8]。无论体内、还是体外环境，KISS1皆可对细胞迁移与浸润施以有效抑制[9，10]。当前围绕肿瘤开展众多的研究结果已证实，KISS1属于一类MSG，显著影响肿瘤的形成、发展，诸如肝癌(HCC)[11]、乳腺癌(BC)[12]、结直肠癌(CRC)[13]等。滋养细胞为胎盘组织的主要成分，显著影响整个妊娠。在妊娠发展下，此细胞会演变为绒毛滋养层细胞(HVTs)以及绒毛外滋养层(EVTs)。HVTs可生成绒毛膜绒毛，负责将营养物质输送给胎儿;EVTs则侵入蜕膜组织与血管内皮，进行螺旋动脉的重建，导致螺旋动脉丧失收缩机能，由此充足母体血流可向绒毛间转移，进而使胎盘的生理机能得以保持正常。就特性而言，相较于正常细胞、肿瘤细胞，滋养细胞介于两者之间，对于胎盘发育，正常滋养层细胞的转移与侵袭发挥着关键作用，早期滋养细胞这些功能的改变会导致子宫胎盘血流的变化，并影响胎盘的结构和功能。有研究表明，KISS1高表达于人胎盘滋养层细胞(TB)内，对滋养细胞的浸润与增殖可能存在影响性[14]。同时PE胎盘内KISS1的表达水平有所上升，在胎盘发育过程中起到抑制滋养层浸润的作用[15]。从而导致胎盘浅着床而带来的一系列的妊娠并发症。
因此，我们推测，在子痫前期的发病过程中，KISS1基因的表观遗传学调控异常导致基因表达的变化，由此对滋养细胞的生物学行为产生影响，从而参与子痫前期的发病。本研究旨在通过对胎盘组织中KISS1基因的表达及调控机制的研究，揭示KISS1基因在子痫前期发病的机制方面可能发挥的作用，为子痫前期的临床预测及后续治疗提供理论依据。
第一部分KISS1基因在PE患者胎盘组织中的表达分析
研究目的:
研究KISS1mRNA与相关蛋白在PE患者、正常晚期妊娠女性胎盘组织内的表达状况，探讨KISS1基因在子痫前期患者胎盘中的表达特点。
研究方法:
1、研究对象:
选取2017.1～2018.1于青岛大学附属医院接受院内治疗且分娩方式为剖宫产的28名重度PE病人归入子痫前期组(PE组，n=28)，将同期30名正常妊娠并择期行剖宫产女性归入正常对照组(NC组，n=30)。
2、实验方法:
应用qRT-PCR技术测定KISS1mRNA于PE重度病人、正常晚期妊娠女性胎盘组织内的表达水平，同时通过WesternBlot(WB)技术对KISS1蛋白表达展开测定。
研究结果:
1、重度PE组与NC组，在平均年龄、胎次与体重指数(BMI)方面，无显著性差异(P＞0.05)。在新生儿出生体重、分娩孕周、舒张压(DBP)、收缩压(SBP)、24小时尿蛋白量、新生儿Apgar1min评分这6项指标，存在显著性差异(P＜0.05)。
2、qRT-PCR检测结果，PE组胎盘组织内KISS1mRNA相对表达量高于正常妊娠组(NC)(P＜0.05)。
3、WB检测结果，PE组胎盘组织内KISS1相关蛋白的相对表达量高于正常妊娠组(NC)(P＜0.05)。
研究结论:
1、KISS1基因及相关蛋白在正常妊娠妇女和重度子痫前期患者中均有表达。
2、重度患者胎盘组织中KISS1mRNA及相关蛋白的表达量均高于正常妊娠组。
第二部分敲除KISS1基因通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路对氧化应激状态下人类胎盘滋养细胞损伤的保护作用
研究目的:
以人滋养细胞株HTR8/Svneo为研究对象，利用250μMol过氧化氢预处理HTR8细胞4小时建立滋养细胞氧化应激模型，模拟子痫前期患者胎盘组织氧化应激环境，研究各组滋养细胞自噬、凋亡及生物学行为的变化。转染si-KISS1和3-MA操作后，重新评估上述生物学过程，以确定敲除KISS1对过氧化氢损伤的HTR8/Svneo细胞的影响。检测PI3K/AKT/mTOR信号通路磷酸化情况，探讨其作用机制，为子痫前期的早期预测和有效治疗提供新思路。
研究方法:
给予250μMol过氧化氢预处理HTR8/Svneo滋养细胞4小时，采用qRT-PCR技术，测定KISS1基因，Beclin1、LCII(自噬相关基因)的表达，通过WB法测定相关蛋白的表达，借助细胞活力测定实验(CCK8法)、Transwell侵袭实验以及流式细胞术(FCM)，检测过氧化氢干预组与正常组HTR8细胞自噬的变化及生物学行为(细胞活力，侵袭和凋亡能力)的差异。在转染siRNA和3-MA(选择性的PI3K抑制剂)操作后，重新评估上述生物学过程，以确定沉默KISS1对过氧化氢损伤的HTR8细胞的影响。并利用WesternBlot检测PI3K/AKT/mTOR通路相关基因p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白水平的变化，推测其可能发生的机制。
研究结果:
1、qRT-PCR检测结果显示:在氧化应激状态下HTR8/Svneo细胞发生过度自噬的现象，与对照组相比，H2O2处理增强了自噬标记物(Beclin-1和LC3B)的mRNA表达水平(P＜0.01)。同样，Westernblot检测结果也揭示了过氧化氢处理后，HTR8细胞内LC3B与Beclin-1蛋白水平皆上调(P＜0.01)，且差异具有显著性。
2、CCK8细胞活力实验、transwell实验和流式细胞术结果显示:H2O2处理的HTR8细胞活力较NC组明显减弱(P＜0.01)，侵袭力明显降低(P＜0.01)，并引发了细胞的凋亡(P＜0.01)。WesternBlot检测结果显示:促进细胞侵袭和转移的MMP-9蛋白水平下降(P＜0.1)而Bax和caspase-3裂解增加(P＜0.001)，促进了凋亡的发生。差异均具有统计学意义。
3、qRT-PCR和Westernblot检测结果显示:过氧化氢干预组较对照组，KISS1mRNA水平升高(P＜0.01)。KISS1蛋白水平也升高。这些相关结果表明，氧化应激状态下HTR8细胞中KISS1的表达水平增加。差异具有统计学意义。
4、siRNA介导的KISS1水平的下调后，与si-NC转染组相比，HTR8细胞KISS1的蛋白与mRNA水平皆为显著降低表现(P＜0.01)。
5、siKISS1+H2O2+HTR8组较H2O2+HTR8组，Beclin-1和LC3B水平降低(P＜0.001);3MA+H2O2+HTR8组较H2O2+HTR8组，Beclin-1和LC3B水平降低(P＜0.001)表明过氧化氢刺激诱发的Beclin-1和LC3B的增强主要被3-MA(PI3K抑制剂)逆转(P＜0.001)。差异具有统计学意义。
6、CCK8细胞活力实验、transwell实验和流式细胞术结果显示:siKISS1+H2O2+HTR8组较H2O2+HTR8组，细胞活力增强(P＜0.001)，侵袭能力增强(P＜0.001)，促侵袭相关蛋白(MMP9)升高(P＜0.001);促凋亡相关蛋白表达水平(cleaved-caspases3，Bax)下降(P＜0.001)，差异具有统计学意义。3MA+H2O2+HTR8组有相似的结果。
7、Westernblot检测结果显示:H2O2-HTR8组较HTR8组，信号通路PI3K/AKT/mTOR中p/t-mTOR、p/t-PI3K与p/t-AKT蛋白表达量下调，表明氧化应激状态下抑制了PI3K/AKT/mTOR信号通路，差异具有统计学意义(P＜0.001)。
8、Westernblot检测结果显示:3MA+H2O2-HTR8组较H2O2-HTR8组PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因p/t-PI3K、p/t-AKT和p/t-mTOR蛋白表达量均上调，结果有统计学意义(P＜0.001)。
9、Westernblot检测结果显示:Si+KISS1+H2O2组较H2O2-HTR8组，PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因p/t-PI3K、p/t-AKT和p/t-mTOR蛋白表达水平升高，结果有统计学意义(P＜0.001)。
研究结论:
1、过氧化氢干预后氧化应激状态下滋养细胞(H2O2+HTR8)，KISS1表达水平升高，自噬相关基因及蛋白表达均较正常滋养细胞增高，发生了过度自噬的现象。
2、过氧化氢干预后氧化应激状态下滋养细胞(H2O2+HTR8)活力下降，侵袭力降低，同时促进了细胞的凋亡。
3、敲除KISS1和3-MA干预逆转了过氧化氢处理的氧化应激状态下HTR8滋养细胞的损伤。抑制了过度自噬，促进氧化应激状态下人类绒毛膜滋养细胞的侵袭和增殖，抑制凋亡，可能通过调控经典的自噬信号通路PI3K/AKT/mTOR而发生作用。滋养细胞是胎盘形成的主要部分，因此我们推测，在子痫前期的发病过程中，KISS1有可能通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路而参与子痫前期的发病。
子痫前期(PE)是特发于妊娠期女性的一类严重并发症，为现今导致围产期母儿死亡的一大因素，对母婴健康存在极大威胁。其在世界范围内的发病率达2～8％左右，我国的发病率更高，为9.4％。临床上以孕20周以后出现的高血压伴发母体相关综合征(如蛋白尿，肝肾等多脏器功能异常)及胎儿综合征(胎儿生长受限及或羊水过少)为主要表现。根据发病孕周，存在早发型PE(＜34w)以及晚发型PE(≥34w)之分。前者通常进展迅速，发生重度母婴不良并发症的几率更高[4]，严重时可导致胎死宫内、胎盘早剥等不良结局。针对PE，临床通用的监测手段仅为镇静、解痉、降压、纠正低蛋白血症等对症治疗，明确的干预方案依然是终止妊娠，与此同时，引发了诸多相关近远期并发症，诸如早产等。因此能够尽早预测子痫前期的发病，做到尽早预防，有效干预和治疗十分重要。子痫前期发病机制复杂，尚未完全明确，多阶段发展、多病因、多机制的复杂病理过程，现今一致认可的观点是“滋养细胞浸润功能损伤，子宫螺旋动脉无法正常重塑，致胎盘浅着床”[5]。该学说认为，子痫前期患者胎盘形成的早期，滋养细胞增殖和分化异常，凋亡加剧，活性下降，使滋养细胞侵袭活性减弱，无法正常侵入子宫肌壁，由此子宫螺旋小动脉无法正常重塑导致胎盘浅着床，胎盘缺血，由此引发PE。而其发生机制之一是滋养细胞缺血缺氧导致的氧化应激反应。
KISS1基因是学者Lee等[6]于1996年借助消减杂交(SH)与差异显示技术(DD-PCR)揭示人黑色素瘤细胞株相应转移活性时率先发现的，位于1号染色体长臂1q32-q41区，是提取自非转移性恶性黑色素瘤的一类肿瘤转移抑制基因(MSG)[7，8]。无论体内、还是体外环境，KISS1皆可对细胞迁移与浸润施以有效抑制[9，10]。当前围绕肿瘤开展众多的研究结果已证实，KISS1属于一类MSG，显著影响肿瘤的形成、发展，诸如肝癌(HCC)[11]、乳腺癌(BC)[12]、结直肠癌(CRC)[13]等。滋养细胞为胎盘组织的主要成分，显著影响整个妊娠。在妊娠发展下，此细胞会演变为绒毛滋养层细胞(HVTs)以及绒毛外滋养层(EVTs)。HVTs可生成绒毛膜绒毛，负责将营养物质输送给胎儿;EVTs则侵入蜕膜组织与血管内皮，进行螺旋动脉的重建，导致螺旋动脉丧失收缩机能，由此充足母体血流可向绒毛间转移，进而使胎盘的生理机能得以保持正常。就特性而言，相较于正常细胞、肿瘤细胞，滋养细胞介于两者之间，对于胎盘发育，正常滋养层细胞的转移与侵袭发挥着关键作用，早期滋养细胞这些功能的改变会导致子宫胎盘血流的变化，并影响胎盘的结构和功能。有研究表明，KISS1高表达于人胎盘滋养层细胞(TB)内，对滋养细胞的浸润与增殖可能存在影响性[14]。同时PE胎盘内KISS1的表达水平有所上升，在胎盘发育过程中起到抑制滋养层浸润的作用[15]。从而导致胎盘浅着床而带来的一系列的妊娠并发症。
因此，我们推测，在子痫前期的发病过程中，KISS1基因的表观遗传学调控异常导致基因表达的变化，由此对滋养细胞的生物学行为产生影响，从而参与子痫前期的发病。本研究旨在通过对胎盘组织中KISS1基因的表达及调控机制的研究，揭示KISS1基因在子痫前期发病的机制方面可能发挥的作用，为子痫前期的临床预测及后续治疗提供理论依据。
第一部分KISS1基因在PE患者胎盘组织中的表达分析
研究目的:
研究KISS1mRNA与相关蛋白在PE患者、正常晚期妊娠女性胎盘组织内的表达状况，探讨KISS1基因在子痫前期患者胎盘中的表达特点。
研究方法:
1、研究对象:
选取2017.1～2018.1于青岛大学附属医院接受院内治疗且分娩方式为剖宫产的28名重度PE病人归入子痫前期组(PE组，n=28)，将同期30名正常妊娠并择期行剖宫产女性归入正常对照组(NC组，n=30)。
2、实验方法:
应用qRT-PCR技术测定KISS1mRNA于PE重度病人、正常晚期妊娠女性胎盘组织内的表达水平，同时通过WesternBlot(WB)技术对KISS1蛋白表达展开测定。
研究结果:
1、重度PE组与NC组，在平均年龄、胎次与体重指数(BMI)方面，无显著性差异(P＞0.05)。在新生儿出生体重、分娩孕周、舒张压(DBP)、收缩压(SBP)、24小时尿蛋白量、新生儿Apgar1min评分这6项指标，存在显著性差异(P＜0.05)。
2、qRT-PCR检测结果，PE组胎盘组织内KISS1mRNA相对表达量高于正常妊娠组(NC)(P＜0.05)。
3、WB检测结果，PE组胎盘组织内KISS1相关蛋白的相对表达量高于正常妊娠组(NC)(P＜0.05)。
研究结论:
1、KISS1基因及相关蛋白在正常妊娠妇女和重度子痫前期患者中均有表达。
2、重度患者胎盘组织中KISS1mRNA及相关蛋白的表达量均高于正常妊娠组。
第二部分敲除KISS1基因通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路对氧化应激状态下人类胎盘滋养细胞损伤的保护作用
研究目的:
以人滋养细胞株HTR8/Svneo为研究对象，利用250μMol过氧化氢预处理HTR8细胞4小时建立滋养细胞氧化应激模型，模拟子痫前期患者胎盘组织氧化应激环境，研究各组滋养细胞自噬、凋亡及生物学行为的变化。转染si-KISS1和3-MA操作后，重新评估上述生物学过程，以确定敲除KISS1对过氧化氢损伤的HTR8/Svneo细胞的影响。检测PI3K/AKT/mTOR信号通路磷酸化情况，探讨其作用机制，为子痫前期的早期预测和有效治疗提供新思路。
研究方法:
给予250μMol过氧化氢预处理HTR8/Svneo滋养细胞4小时，采用qRT-PCR技术，测定KISS1基因，Beclin1、LCII(自噬相关基因)的表达，通过WB法测定相关蛋白的表达，借助细胞活力测定实验(CCK8法)、Transwell侵袭实验以及流式细胞术(FCM)，检测过氧化氢干预组与正常组HTR8细胞自噬的变化及生物学行为(细胞活力，侵袭和凋亡能力)的差异。在转染siRNA和3-MA(选择性的PI3K抑制剂)操作后，重新评估上述生物学过程，以确定沉默KISS1对过氧化氢损伤的HTR8细胞的影响。并利用WesternBlot检测PI3K/AKT/mTOR通路相关基因p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白水平的变化，推测其可能发生的机制。
研究结果:
1、qRT-PCR检测结果显示:在氧化应激状态下HTR8/Svneo细胞发生过度自噬的现象，与对照组相比，H2O2处理增强了自噬标记物(Beclin-1和LC3B)的mRNA表达水平(P＜0.01)。同样，Westernblot检测结果也揭示了过氧化氢处理后，HTR8细胞内LC3B与Beclin-1蛋白水平皆上调(P＜0.01)，且差异具有显著性。
2、CCK8细胞活力实验、transwell实验和流式细胞术结果显示:H2O2处理的HTR8细胞活力较NC组明显减弱(P＜0.01)，侵袭力明显降低(P＜0.01)，并引发了细胞的凋亡(P＜0.01)。WesternBlot检测结果显示:促进细胞侵袭和转移的MMP-9蛋白水平下降(P＜0.1)而Bax和caspase-3裂解增加(P＜0.001)，促进了凋亡的发生。差异均具有统计学意义。
3、qRT-PCR和Westernblot检测结果显示:过氧化氢干预组较对照组，KISS1mRNA水平升高(P＜0.01)。KISS1蛋白水平也升高。这些相关结果表明，氧化应激状态下HTR8细胞中KISS1的表达水平增加。差异具有统计学意义。
4、siRNA介导的KISS1水平的下调后，与si-NC转染组相比，HTR8细胞KISS1的蛋白与mRNA水平皆为显著降低表现(P＜0.01)。
5、siKISS1+H2O2+HTR8组较H2O2+HTR8组，Beclin-1和LC3B水平降低(P＜0.001);3MA+H2O2+HTR8组较H2O2+HTR8组，Beclin-1和LC3B水平降低(P＜0.001)表明过氧化氢刺激诱发的Beclin-1和LC3B的增强主要被3-MA(PI3K抑制剂)逆转(P＜0.001)。差异具有统计学意义。
6、CCK8细胞活力实验、transwell实验和流式细胞术结果显示:siKISS1+H2O2+HTR8组较H2O2+HTR8组，细胞活力增强(P＜0.001)，侵袭能力增强(P＜0.001)，促侵袭相关蛋白(MMP9)升高(P＜0.001);促凋亡相关蛋白表达水平(cleaved-caspases3，Bax)下降(P＜0.001)，差异具有统计学意义。3MA+H2O2+HTR8组有相似的结果。
7、Westernblot检测结果显示:H2O2-HTR8组较HTR8组，信号通路PI3K/AKT/mTOR中p/t-mTOR、p/t-PI3K与p/t-AKT蛋白表达量下调，表明氧化应激状态下抑制了PI3K/AKT/mTOR信号通路，差异具有统计学意义(P＜0.001)。
8、Westernblot检测结果显示:3MA+H2O2-HTR8组较H2O2-HTR8组PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因p/t-PI3K、p/t-AKT和p/t-mTOR蛋白表达量均上调，结果有统计学意义(P＜0.001)。
9、Westernblot检测结果显示:Si+KISS1+H2O2组较H2O2-HTR8组，PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因p/t-PI3K、p/t-AKT和p/t-mTOR蛋白表达水平升高，结果有统计学意义(P＜0.001)。
研究结论:
1、过氧化氢干预后氧化应激状态下滋养细胞(H2O2+HTR8)，KISS1表达水平升高，自噬相关基因及蛋白表达均较正常滋养细胞增高，发生了过度自噬的现象。
2、过氧化氢干预后氧化应激状态下滋养细胞(H2O2+HTR8)活力下降，侵袭力降低，同时促进了细胞的凋亡。
3、敲除KISS1和3-MA干预逆转了过氧化氢处理的氧化应激状态下HTR8滋养细胞的损伤。抑制了过度自噬，促进氧化应激状态下人类绒毛膜滋养细胞的侵袭和增殖，抑制凋亡，可能通过调控经典的自噬信号通路PI3K/AKT/mTOR而发生作用。滋养细胞是胎盘形成的主要部分，因此我们推测，在子痫前期的发病过程中，KISS1有可能通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路而参与子痫前期的发病。