论文部分内容阅读
弓形虫病是一种由细胞内寄生的原虫--弓形虫引起的人兽共患病。可以感染包括人,家畜、家禽、海洋哺乳动物和鸟类等所有温血动物。猪是弓形虫重要的中间宿主,在弓形虫和弓形虫病的传播过程中起到十分重要的作用。免疫胶体金检测法(ICT)作为一种简单、便捷的血清学诊断方法,无需实验仪器及设备,无需技术人员操作,适合大量样本的初步筛选,尤其适合畜禽场及野外检测。弓形虫致密颗粒蛋白家族中的GRA7在宿主体内持续性表达,在速殖子和缓殖子阶段均可诱导机体的免疫反应,是潜在的弓形虫血清学诊断的具有较高价值的一类分泌抗原。本研究利用重组蛋白GRA7制备弓形虫抗体胶体金试纸条,为实际应用奠定基础。1.利用重组蛋白GRA7建立猪弓形虫抗体间接ELISA方法确定重组蛋白GRA7的包被浓度为5μg/mL、孵育条件为4℃过夜;最佳封闭液浓度为5%(m/v)的脱脂奶粉;猪血清和二抗的工作浓度分别为1:50和1:100,000,作用时间均为90min;TMB最佳显色时间为18min。利用该法检测176份猪血清,与胶体金准ELISA相比,特异性、敏感性分别为93.3%、83.3%,AUC曲线分析结果显示,GRA7-ELISA曲线下面积为0.922,说明该方法稳定性很好。以上结果表明:重组蛋白GRA7作为血清学诊断抗原效果良好,可应用于制备胶体金试纸条。2.利用重组蛋白GRA7制备弓形虫抗体检测胶体金试纸条重组蛋白GRA7标记胶体金的最佳浓度和最佳标记pH分别为7.5μg/mL和pH9.0。检测线(Test line)重组抗原GRA7的最佳划线浓度为1mg/mL,质控线(Control line)兔抗GRA7抗体的最佳划线浓度为1mg/mL。176份猪血清的GRA7-ICT检测结果与Gold-ELISA比较,特异性和敏感性分别是91.4%、83.0%。两种检测方法结果吻合样品的Kappa=0.7570,具有较高的一致性。