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背景结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是重要的与纤维化相关的一类细胞因子,为转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)信号下游高效反应元件,可特异性介导TGF-β1诱导的心肌纤维化。miRNA(MicroRNAs)是长度为11-25个核苷酸的单链非编码小RNAs,能够在转录后水平调节相关基因的表达。近期有研究表明miR-30a(miRNA-30a)参与心肌梗死后心肌纤维化进程。miR-30a的表达变化与TGF-β1、CTGF的表达水平以及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白水平呈相反趋势。由此提示miR-30a可能参与调控TGF-β1和CTGF的转录和翻译,从而影响心肌纤维化进程。目的本研究通过将心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)在缺氧环境中培养模拟心肌梗死体外模型,探究miR-30a的表达水平与TGF-β1、CTGF等纤维化相关指标之间的潜在相关性,了解miR-30a的抑制心肌纤维化效应;研究miR-30a是否通过靶向调控CTGF的表达,从而抑制心肌纤维化。方法1、缺氧条件下培养大鼠心脏成纤维细胞(rat cardiac fibroblasts,RCF)。实时荧光定量PCR法(real-time qPCR)检测心肌miR-30a、TGF-β1、CTGF以及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达变化;蛋白印迹法(western blot,WB)检测TGF-β1、CTGF、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白的表达情况。2、将RCF随机分为五组,空白对照组、缺氧组、缺氧+miR-30a核苷酸模拟物(miR-30amimics)组、缺氧+miR-30amimics+miR-30a 的反义链(AMO-miR-30a)组、缺氧+miR-30a阴性对照(miR-30aNC)组,分别观察TGF-β1、CTGF以及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达情况。3、在非缺氧条件下培养RCF。并分别转染miR-30a mimics、miR-30a inhibitor或miR-30aNC,检测CTGF的mRNA及蛋白表达水平。4、构建双荧光素酶结合CTGF基因的表达载体即CTGF-3’-UTR野生型(CTGF-3’-UTR-WT),与miR-30a共同转染入293T细胞。再构建与双荧光素酶结合且CTGF 3’-UTR中与miR-30a的结合位点基因突变的表达载体即CTGF-3’-UTR突变型(CTGF-3’-UTR-MU)报告基因载体,再与miR-30a共同转染入293T细胞。设立miR-30aNC(scramble siRNA)代替miR-30a为阴性对照组。用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测并分析以上转染后荧光素酶活性,探讨miR-30a的作用靶点。结果1、与空白对照组相比,缺氧条件下培养RCF能够显著上调TGF-β1、CTGF、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达水平(P<0.01)以及α-SMA的表达水平(P<0.05)。缺氧条件下,miR-30a表达量较对照组显著下调(P<0.01)。2、缺氧+miR-30amimics组,相对缺氧+miR-30aNC组能够显著抑制缺氧诱导的RCF中TGF-β1、CTGF以及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达量的升高(P<0.05)。然而当细胞共转染AMO-miR-30a时,相对缺氧+miR-30aNC组,缺氧诱导的RCF中TGF-β1、CTGF以及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达量未见显著抑制(P>0.05)。3、摒除缺氧环境影响,RCF的CTGF表达水平经miR-30a mimics处理后显著降低(P<0.05)。然而经miR-30a inhibitor处理后CTGF表达水平显著增加(P<0.01)。4、CTGF-3’-UTR-WT+miR-30a 组对比 CTGF-3’-UTR-WT+miR-30aNC 组以及CTGF-3’-UTR-MU+miR-30a组,荧光素酶活性均被显著抑制(P<0.01)。CTGF-3’-UTR-MU+miR-30-NC 组、CTGF-3’-UTR-MU+miR-30a 组对比CTGF-3’-UTR-WT+miR-30aNC组,荧光素酶活性未见显著改变(P>0.05)。上述结果说明CTGF是miR-30a的靶基因之一。结论1、缺氧上调RCF纤维化相关指标的表达水平,抑制RCFmiRNA-30a的表达。2、miR-30a通过下调心脏成纤维细胞TGF-β1、CTGF的表达,抑制缺氧诱导的心肌纤维化。3、CTGF是miR-30a的靶基因之一。miR-30a能够直接抑制CTGF的表达而发挥抗心肌纤维化效应。