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第一部分促微管聚合蛋白3(TPPP3)在细胞增殖及肿瘤生长中的作用研究目的：研究TPPP3在细胞增殖及肿瘤生长中的作用。方法：用聚合酶链式反应(PCR)克隆TPPP3基因完整的读码框序列。用Northern Blotting检测TPPP3 mRNA在大鼠各组织中的表达水平。构建了TPPP3的原核表达质粒(PET28a-TPPP3),表达His-TPPP3融合蛋白,并用此融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备特异性的TPPP3多克隆抗体。构建表达TPPP3的真核表达载体,观察此蛋白在真核细胞中的定位。构建抑制TPPP3表达的MicroRNA (miRNA)的RNA干扰质粒,将此质粒转染入HeLa细胞,产生对TPPP3蛋白表达的瞬时抑制。随后观察HeLa细胞在体外的增殖,凋亡,细胞周期的变化,及有丝分裂期的表象。用该质粒转染Lewis Lung Carcinoma(LLC)细胞,筛选得到稳定转染株细胞(TPPP3-knockdown LLC或controlLLC),产生对TPPP3基因的稳定抑制。将此稳定转染干扰质粒的LLC细胞种植到C57B1/6小鼠皮下,观察由TPPP3-knockdown LLC细胞和对照细胞形成的肿瘤大小。用Transwell实验检测TPPP3-knockdown LLC细胞在体外的迁移和侵袭能力。将TPPP3-knockdown LLC细胞和对照细胞从尾静脉注射入C57B1／6小鼠体内,观察3周后在小鼠肺中形成肿瘤的数量和大小。结果：克隆得到TPPP3的cDNA全长读码框序列。Northern blotting结果显示TPPP3 mRNA在大鼠的肺和主动脉表达较高。制备成功能特异识别TPPP3蛋白的多克隆抗体。成功筛选到能抑制TPPP3表达的特异性miRNA序列,并在HeLa细胞中抑制TPPP3蛋白表达。抑制了TPPP3后,HeLa细胞出现了生长的迟滞,细胞周期的阻滞,凋亡的增加,有丝分裂异常象的出现(形成多极纺锤体)。随后,我们筛选得到稳定转染干扰质粒的LLC细胞株。将TPPP3-knockdown LLC细胞株和稳定转染了对照质粒的细胞株种植于C57B1／6小鼠皮下,结果显示抑制了TPPP3的LLC细胞形成的肿瘤比对照小。Transwell实验显示抑制了TPPP3后LLC细胞的迁移和侵袭能力下降。将LLC细胞注射到小鼠的尾静脉中后,发现注射了TPPP3-knockdown LLC细胞的小鼠相对于对照组小鼠在肺内形成的肿瘤转移灶小并且数量少。结论：1)TPPP3是一个广泛表达于多种组织的较新基因。2)抑制TPPP3后减慢细胞增殖,诱发有丝分裂异常象的出现。3)抑制TPPP3后减慢皮下种植的肿瘤的生长。4)抑制了TPPP3后使得细胞在体外的迁移和侵袭能力减弱。5)抑制TPPP3后一定程度遏制了肿瘤细胞在小鼠体内的转移。第二部分Prokineticin 2 (PK2)在体温调节和能量代谢中的作用目的：研究PK2敲除(PK2-/-)小鼠在食物受限条件下体温调节和能量代谢。方法：原位杂交检测小鼠脑内室旁核(PVN)中PK2 mRNA的表达。脑室注射2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)模拟体内葡萄糖缺乏,检测PVN中PK2 mRNA的表达。用实验室动物能量代谢检测系统(Comprehensive Lab Animal Monitoring System, CLAMS)检测小鼠的进食量,氧气消耗,二氧化碳消耗及呼吸商值。测定小鼠运动：笼子中装有32个红外线发射体和接受器,小鼠在此笼子中自发运动的次数是通过记录在单位时间内其阻断红外线的次数。测定小鼠的体温：将能感知体温的无线发生器埋植于小鼠腹部皮下,接收信号装置处于小鼠笼子底下,定期记录小鼠体温的变化。检测小鼠的清醒和睡眠：脑电图(EEG)电极植入小鼠的正前方及顶部的脑皮质,肌电图(EMG)电极埋于小鼠颈后部肌肉中,将EEG和EMG的信号输入电脑处理。结果：在小鼠正常饮食条件下,PK2 mRNA在其脑内PVN部位不表达,但是禁食或脑内注射2-DG都能诱导PK2在PVN中的表达,并且随着禁食时间的增加其表达也增高。在禁食条件下,PK2-/-小鼠和WT小鼠都出现体温下降。但是PK2-/-小鼠体温下降明显并且维持低体温的时间长。小鼠体温下降主要发生在白昼时段,在这个过程中两组小鼠基本处于静止不活动状态。其体温下降主要是由体内基础能量代谢的差异造成的。此外,PK2-/-小鼠和WT小鼠在禁食后诱发的黑夜时相的活动比其在正常饮食条件下多,但是PK2-/-小鼠诱发的活动比WT小鼠少。在禁食中PK2-/-小鼠的氧气消耗,二氧化碳消耗,呼吸商的值都比WT小鼠低。但其体重下降程度比WT小鼠小。同时,和正常饮食条件下比较,在禁食后WT小鼠的唤醒状态维持的时间长,但是PK2-/-小鼠不出现这个由饥饿诱导的警觉性提高的反应。除禁食外,我们又观察了在给予体重的5%的食物条件下两组小鼠的代谢和体温变化。5%体重的食物给予相对于禁食能缓解WT小鼠的体温的下降,但是对于PK2-/-小鼠无明显的作用。5%体重的食物给予能缓解在禁食下WT小鼠体重的下降,但是对PK2-／-小鼠无明显作用。5%体重食物给予时PK2-／-小鼠的氧气消耗量,二氧化碳的消耗量,呼吸商的值都比WT小鼠要低。结论：在禁食的条件下,体内葡萄糖水平下降能使得脑内PVN核团中PK2表达增加,说明PK2作为一种感受葡萄糖能量缺乏的信号作用于PVN核团中,从而产生神经应激反应。在小鼠禁食或食物数量受限的情况下,PK2能提升机体的应激反应：如增加觅食活动,提高警觉性,动用体内能量储备供能来维持体温,避免体温的下降。相对于WT小鼠,PK2信号缺失的小鼠在禁食时容易发生体温下降,并且不能很好地动用体内的能源物质,从而导致机体的代谢率降低。同时我们发现当缺失了PK2信号时,动物对食物的利用效率降低。