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猪δ冠状病毒(PDCoV)是一种新型的猪肠道冠状病毒，主要引起仔猪腹泻。2014年首次在美国猪场中爆发，随后在多个国家的猪场中相继爆发，给养猪行业带来了巨大的经济损失，而目前还没有发现针对PDCoV的有效疫苗或抗病毒药物。本试验从68份PDCoV阳性的猪腹泻病料中，应用猪睾丸细胞(ST)和猪肾上皮细胞(LLC-PK1)成功分离出3株PDCoV毒株，分别命名为HNZK-02、HNZK-04和HNZK-06，并对HNZK-04进行生物学特性研究、细胞传代的PDCoV的全基因组序列测定及其遗传进化分析，且对广谱类抗病毒药物L J001在体外对PDCoV的抗病毒活性进行了研究，本研究结果具体如下:
1、PDCoV流行毒株的分离、鉴定及生物学特性研究
本试验将68份PDCoV阳性的猪腹泻病料处理后分别接种ST和LLC-PK1细胞，其中有3份病料在感染细胞后出现典型的细胞病变。将3株病毒在细胞上传代至P5代，通过RT-PCR和间接免疫荧光试验对所分离的病毒进行鉴定，确定分离出了3株PDCoV，并将其命名为HNZK-02、HNZK-04和HNZK-06。选取PDCoV HNZK-04毒株继续在LLC-PK1细胞上传代，并采用蚀斑纯化技术对P5、P10和P15代细胞毒进行纯化，然后继续将PDCoV HNZK-04传至P60，其中PDCoVHNZK-04P5、P10、P15、P20和P30代细胞毒的病毒效价在6.33-8.4lgTCID50/0.1mL之间。
为了解PDCoV的生物学特性，本试验测定了其中PDCoV HNZK-04在LLC-PK1细胞上的生长曲线，不同MOI(0.1、0.01)的PDCoV HNZK-04-P20病毒感染细胞，分别在不同时间点收毒，通过荧光定量PCR及TCID50试验测定病毒滴度。荧光定量PCR结果表明病毒感染LLC-PK1后，在24h左右病毒的RNA滴度达到高峰(11.19log10GE/mL)，随即开始平缓;TCID50试验结果表明，病毒感染细胞后，病毒滴度持续上升，在24h左右病毒的滴度达到高峰(7.5lgTCID50/0.1mL)，随即开始平缓，60h开始下降。
为了解PDCoV的血凝活性，本试验采集并制备了猪、兔、小鼠和人的红细胞，用PDCoV HNZK-04P30细胞毒进行红细胞凝集试验，结果显示，PDCoV HNZK-04P30不与猪、小鼠、兔和人的红细胞发生凝集，用不同浓度的胰酶处理病毒之后，病毒HNZK-04P30仍不与猪、鸡、小鼠和人的红细胞发生凝集，但可以与兔的红细胞发生凝集;为了进一步了解PDCoV与兔红细胞的凝集活性是否与唾液酸有关，进而使用不同浓度的神经氨酸酶处理病毒和兔的红细胞，结果表明，病毒经神经氨酸酶处理过之后可以与兔的红细胞发生凝集，100ug/ml的胰酶与5U/ml的神经氨酸酶处理红细胞后，凝集现象消失，表明PDCoV与兔的红细胞的凝集活性和红细胞表面的唾液酸有关。
2、PDCoV HNZK-04P5和P15全基因组测序和遗传变异分析
为了解PDCoV HNZK-04株的遗传变异情况，以GenBank上公布的HKU15-155(JQ065043)PDCoV序列，设计合成了涵盖整个PDCoV的13对引物，通过RT-PCR对HNZK-04-P5和P15进行全基因扩增并拼接，将其与PDCoV HNZK-04(MH708124)原始病料进行序列比对，结果表明，HNZK-04P5和P15序列一致，表明病毒在P5代传至P15代期间核苷酸和氨基酸均为发生改变;HNZK-04-P5和P15与原始病料序列比对结果表明，共发生4处核苷酸的突变，分别在10959处(ORF)的位置核苷酸由G突变为A，在19735、21252和21972（S基因）处核苷酸分别由G突变为C、C突变为A、T突变为A，而其中19735、21252和21972的核苷酸突变引起了氨基酸的突变，分别由天冬氨酸(D)突变为组氨酸(H)、谷氨酰胺(Q)突变为赖氨酸(K)、甲硫酰胺(M)突变为赖氨酸(K)，10595的核苷酸突变引起了色氨酸(W)的缺失，表明病毒在细胞上传代的过程中基因序列发生了改变。将PDCoV HNZK-04（原始病料株）及GenBank上的国内外毒株进行序列比对，结果表明，HNZK-04-P5和P15毒株与中国大部分毒株、美国毒株处于一大亚群，HNZK-04P5和P15与美国毒株的同源性为98.8％-99.0％，与中国株的同源性为98.4％-99.8％，与韩国株同源性为99.0％，与东南亚毒株的同源性为74.7-96.7％，其中N、S、M和E基因中均发生了突变，其中一些突变引起了对应的氨基酸的突变。
3、药物LJ001对PDCoV抑制作用的研究
为研究LJ001对PDCoV的体外抑制情况，首先采用四甲基偶氮唑盐(MTT)试验确定药物在ST细胞上的安全范围度，结果表明其CC50为146.4μM，安全浓度小于25μM。在安全浓度范围内设定不同浓度的药物（12.5μM、3.125μM和0.782μM），采用三种不同的作用方式（先接毒后加药物、药物和病毒同加及先加药物后接毒）进行试验，病毒感染后24h收取样品并进行TCID50试验。结果显示采用先接毒后加药物及药物与病毒同加的作用方式时抑制效果比较明显，为进一步了解药物具体是在病毒感染细胞的哪个阶段起作用，采用3.125μM的药物进行了以下试验:(1)药物和病毒在ST细胞上作用2h后收取样品，进行荧光定量PCR试验，结果显示，药物对PDCoV的RNA滴度没有明显的抑制效果，表明药物在PDCoV的吸附和入侵阶段没有明显的抑制效果;(2)PDCoV感染ST细胞吸附一个小时，洗掉未吸附病毒，添加药物，分别在感染后6、12和24h收取病毒，分别通过TCID50和荧光定量PCR试验进行病毒滴度检测。结果显示:病毒感染细胞6h和12h后，与药物未处理组对比降低了1.5个TCID50/0.1ml，表明药物在PDCoV的复制阶段具有抑制作用;病毒感染细胞24h后，与药物未处理组降低了2.2个TCID50/0.1ml，表明在PDCoV的释放阶段抑制效果最为显著。证明LJ001对PDCoV具有抗病毒活性，且在病毒感染细胞的复制及释放阶段抑制效果最为显著，为后期PDCoV的防控提供了重要的依据。
1、PDCoV流行毒株的分离、鉴定及生物学特性研究
本试验将68份PDCoV阳性的猪腹泻病料处理后分别接种ST和LLC-PK1细胞，其中有3份病料在感染细胞后出现典型的细胞病变。将3株病毒在细胞上传代至P5代，通过RT-PCR和间接免疫荧光试验对所分离的病毒进行鉴定，确定分离出了3株PDCoV，并将其命名为HNZK-02、HNZK-04和HNZK-06。选取PDCoV HNZK-04毒株继续在LLC-PK1细胞上传代，并采用蚀斑纯化技术对P5、P10和P15代细胞毒进行纯化，然后继续将PDCoV HNZK-04传至P60，其中PDCoVHNZK-04P5、P10、P15、P20和P30代细胞毒的病毒效价在6.33-8.4lgTCID50/0.1mL之间。
为了解PDCoV的生物学特性，本试验测定了其中PDCoV HNZK-04在LLC-PK1细胞上的生长曲线，不同MOI(0.1、0.01)的PDCoV HNZK-04-P20病毒感染细胞，分别在不同时间点收毒，通过荧光定量PCR及TCID50试验测定病毒滴度。荧光定量PCR结果表明病毒感染LLC-PK1后，在24h左右病毒的RNA滴度达到高峰(11.19log10GE/mL)，随即开始平缓;TCID50试验结果表明，病毒感染细胞后，病毒滴度持续上升，在24h左右病毒的滴度达到高峰(7.5lgTCID50/0.1mL)，随即开始平缓，60h开始下降。
为了解PDCoV的血凝活性，本试验采集并制备了猪、兔、小鼠和人的红细胞，用PDCoV HNZK-04P30细胞毒进行红细胞凝集试验，结果显示，PDCoV HNZK-04P30不与猪、小鼠、兔和人的红细胞发生凝集，用不同浓度的胰酶处理病毒之后，病毒HNZK-04P30仍不与猪、鸡、小鼠和人的红细胞发生凝集，但可以与兔的红细胞发生凝集;为了进一步了解PDCoV与兔红细胞的凝集活性是否与唾液酸有关，进而使用不同浓度的神经氨酸酶处理病毒和兔的红细胞，结果表明，病毒经神经氨酸酶处理过之后可以与兔的红细胞发生凝集，100ug/ml的胰酶与5U/ml的神经氨酸酶处理红细胞后，凝集现象消失，表明PDCoV与兔的红细胞的凝集活性和红细胞表面的唾液酸有关。
2、PDCoV HNZK-04P5和P15全基因组测序和遗传变异分析
为了解PDCoV HNZK-04株的遗传变异情况，以GenBank上公布的HKU15-155(JQ065043)PDCoV序列，设计合成了涵盖整个PDCoV的13对引物，通过RT-PCR对HNZK-04-P5和P15进行全基因扩增并拼接，将其与PDCoV HNZK-04(MH708124)原始病料进行序列比对，结果表明，HNZK-04P5和P15序列一致，表明病毒在P5代传至P15代期间核苷酸和氨基酸均为发生改变;HNZK-04-P5和P15与原始病料序列比对结果表明，共发生4处核苷酸的突变，分别在10959处(ORF)的位置核苷酸由G突变为A，在19735、21252和21972（S基因）处核苷酸分别由G突变为C、C突变为A、T突变为A，而其中19735、21252和21972的核苷酸突变引起了氨基酸的突变，分别由天冬氨酸(D)突变为组氨酸(H)、谷氨酰胺(Q)突变为赖氨酸(K)、甲硫酰胺(M)突变为赖氨酸(K)，10595的核苷酸突变引起了色氨酸(W)的缺失，表明病毒在细胞上传代的过程中基因序列发生了改变。将PDCoV HNZK-04（原始病料株）及GenBank上的国内外毒株进行序列比对，结果表明，HNZK-04-P5和P15毒株与中国大部分毒株、美国毒株处于一大亚群，HNZK-04P5和P15与美国毒株的同源性为98.8％-99.0％，与中国株的同源性为98.4％-99.8％，与韩国株同源性为99.0％，与东南亚毒株的同源性为74.7-96.7％，其中N、S、M和E基因中均发生了突变，其中一些突变引起了对应的氨基酸的突变。
3、药物LJ001对PDCoV抑制作用的研究
为研究LJ001对PDCoV的体外抑制情况，首先采用四甲基偶氮唑盐(MTT)试验确定药物在ST细胞上的安全范围度，结果表明其CC50为146.4μM，安全浓度小于25μM。在安全浓度范围内设定不同浓度的药物（12.5μM、3.125μM和0.782μM），采用三种不同的作用方式（先接毒后加药物、药物和病毒同加及先加药物后接毒）进行试验，病毒感染后24h收取样品并进行TCID50试验。结果显示采用先接毒后加药物及药物与病毒同加的作用方式时抑制效果比较明显，为进一步了解药物具体是在病毒感染细胞的哪个阶段起作用，采用3.125μM的药物进行了以下试验:(1)药物和病毒在ST细胞上作用2h后收取样品，进行荧光定量PCR试验，结果显示，药物对PDCoV的RNA滴度没有明显的抑制效果，表明药物在PDCoV的吸附和入侵阶段没有明显的抑制效果;(2)PDCoV感染ST细胞吸附一个小时，洗掉未吸附病毒，添加药物，分别在感染后6、12和24h收取病毒，分别通过TCID50和荧光定量PCR试验进行病毒滴度检测。结果显示:病毒感染细胞6h和12h后，与药物未处理组对比降低了1.5个TCID50/0.1ml，表明药物在PDCoV的复制阶段具有抑制作用;病毒感染细胞24h后，与药物未处理组降低了2.2个TCID50/0.1ml，表明在PDCoV的释放阶段抑制效果最为显著。证明LJ001对PDCoV具有抗病毒活性，且在病毒感染细胞的复制及释放阶段抑制效果最为显著，为后期PDCoV的防控提供了重要的依据。