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雏鸡出壳时立即与外界环境接触,要面临多种应激因素,此时机体的免疫状况直接影响存活率和整个生命周期。众多研究表明,胚蛋注射疫苗可以有效诱导鸡胚产生免疫应答反应,从而增强出壳后雏鸡初期的抗病毒感染能力。新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）可以诱导家禽体液免疫产生保护性抗体,是新型基因工程疫苗的候选抗原。本研究选择NDV HN基因构建重组乳酸菌基因工程疫苗,并将其进行胚蛋免疫注射,既可以发挥乳酸菌的作用对雏鸡早期生长发育和免疫功能进行调节,又能够诱导雏鸡较早产生NDV保护性抗体对机体进行免疫保护,这对于提高家禽养殖效益具有积极意义。本试验首先克隆NDV La Sota株HN基因,以干酪乳酸杆菌pPG612为载体构建了细胞表面表达型HN基因重组乳酸菌（Lactobacillus casei-pPG612-Newcastle disease virus,Lc-pPG-HN）,通过PCR扩增得到1617 bp HN基因片段,Western blotting条带清晰,蛋白大小63 k Da;通过荧光显微镜可见明显荧光信号,检测重组乳酸菌遗传稳定性,重组乳酸菌能够稳定表达HN蛋白;以90羽健康雏鸡随机分3个处理组,每个处理组5个重复,每个重复6羽进行口服免疫保护性实验。处理组如下:生理盐水组（Control）、空载菌对照组（Lc-pPG）、重组疫苗组（Lc-pPG-HN）,在1、7、14和21日龄检测生长发育相关指标,检测血清样品中HI抗体水平、IL-2、IFN-γ含量,以及肠灌洗液中SIgA含量,验证重组菌够稳定表达HN蛋白,具有很好的反应原性和免疫原性后,进行以下的胚蛋注射研究:胚蛋注射试验以900枚SPF受精种蛋作为试验对象,随机分成6组,每个处理组5个重复,每个重复30枚蛋。处理组如下:未注射对照组（unjection）、注射PBS组（PBS）、注射新城疫疫苗组（NDV）、注射新城疫疫苗+空载菌Lc-pPG混合液组（NDV+Lc）、注射1×109CFU/m L重组乳酸菌低剂量组（Lc-pPG1-HN）、注射1×1011CFU/m L重组乳酸菌高剂量组（Lc-pPG2-HN）,按正常孵化程序孵化至18.5胚龄,将乳糖诱导后的重组乳酸菌和其他组的对应溶液分别注入羊膜腔中,每枚蛋的注射剂量为0.2m L。其中未注射对照组出壳后1日龄,随机选择50羽健康雏鸡口服ND疫苗后进行单独饲养（1DPI组）,用于与胚胎免疫效果进行比较。统计6组的孵化率和出孵重,在相同日龄检测生长发育相关指标,观察免疫器官和黏膜形态结构的显著变化,测定空肠消化酶活性,统计肠道黏膜内IgA+细胞及IgG抗体定位分布;注射不同剂量的重组乳酸菌都可以提高种蛋孵化率和雏鸡的出孵重,但差异不显著（P>0.05）;Lc-pPG2-HN组显著增加了SPF雏鸡的体增重（BWG）,降低了料肉比（FCR）（P<0.05）;不同剂量的重组乳酸菌和NDV+Lc组促进了免疫器官的发育,显著增加了14-21日龄的免疫器官指数（P<0.05）;改善了小肠黏膜形态,增加了绒毛高度（VH）,降低了隐窝深度（CD）,显著提高14-21日龄绒腺比（P<0.05）,增加了SPF雏鸡空肠的消化酶（淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶）活性,其中不同剂量的重组乳酸菌注射组的各项指标都高于NDV+Lc组。第14和21日龄,注射NDV+Lc和不同剂量重组乳酸菌诱导机体分泌SIgA,增加十二指肠、空肠和回肠绒毛固有层内的IgA+的数量,主要集中在肠绒毛顶端;IgG抗体在肠黏膜组织中分布广泛,其中Lc-pPG2-HN组十二指肠、空肠最为显著。荧光定量PCR方法检测空肠、回肠和脾脏中细胞因子（IL-2、IL-6、IFN-γ、TLR4）及14和21日龄空肠、回肠中黏膜屏障蛋白（mucin-1、ZO-1、occludin）m RNA表达水平的变化,从盲肠组织中提取细菌DNA,统计Bifidobacterium spp.、Lactobacillus spp.、E.coli和Enterococcus spp.菌群相对丰度。检测血液中细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ）和SIgA含量。利用MTT增殖法和流式细胞术统计血液和脾脏中分离的淋巴细胞增殖情况及CD4+CD8+T淋巴细胞百分比含量。与PBS对照组比较,注射NDV、NDV+Lc和不同剂量重组乳酸菌,在21日龄显著增加了空肠和回肠黏膜屏障蛋白以及细胞因子的m RNA相对表达量（P<0.05）。第14日龄,Lc-pPG2-HN组显著地提高了3种益生菌相对菌群丰度（P<0.05）,降低了大肠杆菌的相对菌群丰度;与NDV+Lc组比,不同剂量重组乳酸菌能够显著促进14和21日龄血清的HI和SIgA抗体分泌（P<0.05）,诱导血清产生较高水平的细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ）,刺激淋巴细胞增殖,Lc-pPG2-HN组显著提高了SPF雏鸡血液和脾脏中CD4+CD8+T淋巴细胞百分比含量（P<0.05）;第21日龄,脾脏中CD4+CD8+T淋巴细胞百分比含量高达60%;同时增加了脾脏组织细胞因子的m RNA相对表达量。第22日龄,将PBS组、NDV+Lc组、Lc-pPG2-HN组和1DPI组,用NDV弱毒株攻毒后观察临床发病情况和组织器官病理变化,分别检测攻毒前1天和攻毒后第7天血清中NDV HI和肠道灌洗液中SIgA抗体效价水平,统计免疫保护率。在NDV感染后第7天,PBS组SPF雏鸡全部死亡,NDV+Lc、1DPI和Lc-pPG2-HN组的免疫保护率分别为67%、76%和79%;从病理学角度分析,Lc-pPG2-HN组在攻毒后第7天并未出现典型的临床症状,各组织结构无明显病灶;并检测到Lc-pPG2-HN组雏鸡血清和肠道灌洗液分泌的HI和SIgA抗体水平显著高于1DPI组（P<0.05）。综上所述,HN基因重组乳酸菌进行胚蛋羊膜腔注射后,可以进入到鸡胚或在肠道中定植,对肠道黏膜免疫和消化机能、机体的细胞和体液免疫水平以及个体的生长发育有促进作用,并且重组菌表达的HN抗原,能够有效刺激肠道及机体产生攻毒免疫保护。因此,本研究结果为家禽养殖业胚蛋注射乳酸菌载体疫苗的研制提供重要的理论基础及参考数据。