布鲁氏菌属的细菌是兼性胞内寄生菌,属于变形菌门的α-2型分支,会感染多种陆地和水生哺乳动物,包括猪、牛、山羊、绵羊、狗、海豚、鲸鱼、海豹和沙漠木鼠等。动物感染布鲁氏菌后会引起流产、不孕、繁殖成活率低、产肉及产奶量下降、生产能力下降。入侵相关位点B（invasion associated locus B,ialB）基因位于布鲁氏菌第Ⅰ号染色体上,目前关于ialB的报道较少,主要与杆菌样巴尔通体入侵红细胞相关。尽管ialB的同源基因特别是在包括猪布鲁氏菌的根瘤菌目中是广泛保守的,但其可能的酶促反应和/或与宿主之间的相互作用仍然未知。因此构建布鲁氏菌ialB缺失株,研究ialB在布鲁氏菌中可能的功能及其是否对黏附、入侵细胞和胞内存活产生影响对于揭示布鲁氏菌的致病机制具有重要意义。本研究运用同源重组的原理,利用pUC18质粒,构建了pUC18-ialB-KanR载体,再将构建好的载体电击转入布鲁氏菌S2株的感受态细胞,经过抗生素筛选以及PCR和荧光定量PCR鉴定,得到布鲁氏菌ialB的缺失菌。再运用DNA无缝克隆技术构建回补载体PBBRori-AMP-ialB,将构建好的载体电击转入布鲁氏菌ialB缺失株的感受态细胞,经抗生素筛选、PCR和Western Blot鉴定等得到回补株。进一步测定了布鲁氏菌S2株、布鲁氏菌ialB缺失株、回补株的基本生物学特性以及上述三株菌黏附、入侵RAW264.7细胞和在RAW264.7细胞内增殖能力。试验结果如下:1.通过同源重组技术,构建了布鲁氏菌ialB的缺失株;通过DNA无缝克隆技术,构建了回补株。2.通过观察菌落在TSA平板上的形态、测定生长曲线和检测细菌活力,发现布鲁氏菌ialB缺失株的生长受到抑制,活力比布鲁氏菌S2株和回补株低;检测布鲁氏菌S2株、布鲁氏菌ialB缺失株、回补株在应对酸应激、高渗应激、低渗应激、氧化应激和多黏菌素B应激时的存活率,发现布鲁氏菌ialB缺失株在酸应激、高渗应激、低渗应激和多黏菌素B应激条件下存活率比布鲁氏菌S2株和回补株低,在氧化应激条件下存活率比布鲁氏菌S2株和回补株高;扫描电镜观察上述三株菌的形态,发现布鲁氏菌ialB缺失株与布鲁氏菌S2株相比,长度变短,直径增加,形态整体变圆。3.实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌S2株、布鲁氏菌ialB缺失株、回补株的极生长相关基因、肽聚糖合成相关基因、OMPs相关基因、脂多糖转运蛋白相关基因的表达,结果表明布鲁氏菌ialB缺失株上述基因的表达量与布鲁氏菌S2株相比有所下调。4.检测布鲁氏菌S2株、布鲁氏菌ialB缺失株、回补株在RAW264.7细胞内的增殖,发现布鲁氏菌ialB缺失株胞内增殖比布鲁氏菌S2株和回补株低。以上结果表明,布鲁氏菌ialB缺失株活力降低;极生长可能受到影响,细胞壁合成可能受阻;在RAW264.7细胞内增殖能力降低。