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帕金森病(PD)是最一种常见的慢性神经变性性疾病,是神经退行性疾病之中仅次于阿尔茨海默病(AD)的常见疾病。其发病率在65岁及其以上的人口中约占2%。PD的临床症状包括静止性震颤,运动迟缓,肌僵直和姿势异常,主要病理特征是黑质中多巴胺(DA)能神经元不可逆性的选择性退行性变。迄今为止,对于PD的病因和发病机制还未完全阐明。目前已知的参与因素有氧化应激和线粒体功能障碍等。因此如果某种药物可以抗氧化应激或者可以抑制线粒体功能障碍,将有可能成为治疗PD的新药物。PD发病机制的探讨和潜在治疗药物的筛选及评价,在很大程度上依赖于疾病相关体内外模型的建立及应用,特别是离体细胞模型的建立及应用。MPTP是一种神经毒素,它可以在人类和许多动物实验中诱导产生帕金森病症状。它的毒性主要体现在影响细胞内能量的消耗和自由基的产生。MPTP可由MAO-B转换为它的代谢产物MPP+。MPP+通过高亲和力的DA转运体被选择性的转运到细胞内,并且被DA能神经元内的线粒体吸收,最终通过抑制线粒体电子传递复合物1,破坏细胞内氧化磷酸化过程,导致ATP产生的减少,细胞内钙水平升高,以及自由基的产生,从而表现出DA能神经毒性。因此认为MPTP或MPP+模型是研究PD的经典模型。柴胡皂甙d (Saikosaponin-d, Ssd),柴胡提取物的主要成分之一,具有多种药理活性,包括抗肿瘤,抗炎和免疫调节等。本研究首先以1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+)作为诱导剂,以SH-SY5Y细胞作为模型载体,建立PD细胞损伤模型,观察Ssd 对 SH-SY5Y细胞毒性作用机制及神经保护作用和分子机制,为进一步开发抗PD的药物提供依据和科研思路。目的：1.观察Ssd对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激的抑制作用以及Ssd对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响；2.探讨Ssd抑制MPP+诱导SH-SY5Y细胞的氧化应激和细胞凋亡相关机制；从分子学层面探讨其可能的作用机制。材料和方法：细胞培养和试剂：SH-SY5Y细胞培养基为DMEM/F12基质(Gibco, CA,USA),含10%胎牛血清,100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。培养条件：温度37℃,CO2培养箱(5%CO2/95%空气)。柴胡皂苷d用培养液配成浓度为5mM的储备液,处理细胞时,将储备液用培养液稀释到合适浓度。SSd和MPP+购自sigma (St. Louis, MO, USA)。细胞活力检测采用MTT定量比色测定法评价细胞活性。将对数生长期的SH-SY5Y细胞按5×104密度接种于96孔板。24h后,SH-SY5Y细胞与分别与不同浓度的Ssd(15,30,45μM)孵育5h,然后与MPP+孵育24h。酶标仪在450nm波长处测定光密度,与对照组(活性100%)比较,计算百分率。凋亡试验采用FITC/Annexin V荧光检测试剂盒(BD Biosciences, San Jose,CA)检测细胞凋亡。密度为1×105的SH-SY5Y细胞用FITC/AnnexinV和碘化丙啶染色,使用流式细胞仪监测细胞凋亡(BD Biosciences, San Jose, CA).Caspase-3活性检测密度为1×104的SH-SY5Y细胞用MPP+或Ssd处理24h。采用caspase-3比色分析试剂盒(St. Louis, MO, US)检测caspase-3活性。检测机理为：Caspase-3可水解多肽底物,乙酰化Asp-Glu-Val-Asp对硝基苯胺(Ac-DEVD-pNA),释放pNA。水解反应在缓冲液中进行,缓冲液中需含50μg细胞质蛋白和50 μM caspase特异性底物,酶标仪在405nm处读取光吸收度。自由基生成检测SH-SY5Y细胞与2,7-二氯荧光素二乙酸盐(DCF-DA) (Sigma, St. Louis, MO,USA)于37℃,避光孵育1h,悬浮于PBS中。细胞内自由基的生成通过荧光显微镜来定量(OLYMPUS, Germany).Western blot检测细胞提取液使用SDS-PAGE凝胶电泳分离,转染到硝化纤维滤膜上。转染的纤维膜与SIRT3抗体(滴度1：1000)和GAPDH抗体(滴度1：5000)孵育。经辣根过氧化物酶结合二抗(滴度1：10000)再次孵育,使用发光试剂(Pierce, Rockford, IL进行检测二抗结合情况。所有抗体均购自Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, CA。数据处理数据以平均数士标准差表示。组间差异使用SPSS 16.0软件进行方差分析。P值<0.05,认为差异具有统计意义。结果：1.SSd对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞模型有保护作用。将不同浓度(0,15,30,45,60 μM) SSd 于 SH-SY5Y孵育24h,观察其对细胞活力的影响。结果提示低浓度SSd(15～45μM)不影响细胞增殖,而高浓度(60μM)明显抑制SH-SY5Y生长。与前期研究一致的是,MPP+(0,0.1,0.5,1 and 1.5mM)呈剂量依赖性地降低细胞活力。据此,采用低剂量SSd(15,30,45 μM)和1mM MPP+研究SSd的细胞保护作用。先用SSd(15,30,45μM)与细胞孵育5h,然后与MPP+(1 mM)孵育24h, MTT法检测SSd对细胞活力的影响,图1c数据表明SSd明显增强细胞的活性。2.SSd抑制MPP+诱导SH-SY5Y细胞的自由基蓄积。氧化应激已被确认为包括PD等多种疾病的病理机制。通过检测SH-SY5Y细胞内的自由基水平,来明确SSd对抗MPP+的细胞毒性作用是否为抗氧化机制。图2所示,MPP+可显著增加细胞自由基的产生,而SSd可浓度依赖性降低自由基水平。以上数据提示SSd可降低SH-SY5Y的氧化应激。3.SSd减少MPP+诱导的SH-SY5 Y细胞凋亡。通过比较MPP+孵育SH-SY5Y细胞时加与不加SSd的细胞凋亡情况,观察SSd的抗细胞凋亡作用。流式细胞仪分析提示,SSd可剂量依赖性地抑制MPP+诱导的细胞凋亡。在SSd孵育后,再检测caspase-3活性,来分析凋亡程序。SH-SY5Y细胞经MPP+孵育24h、caspase-3酶活性增加近3倍,SSd可呈剂量依赖性地降低MPP+诱导的caspase-3活性上调。以上结果提示SSd可缓解MPP+诱导的细胞凋亡。4.SSd可上调SH-SY5Y细胞的SIRT3水平。为进一步研究SSd对SH-SY5Y细胞的保护作用的分子机制,我们研究细胞生存与凋亡中的重要角色—SIRT3是否参与SSd的神经保护作用。qRT-PCR数据显示,MPP+可显著降低细胞SIRT3的mRNA水平,而SSd孵育的SH-SY5Y细胞可检测到SIRT3的mRNA水平升高。同样的结果出现在检测SIRT蛋白水平,即MPP+引起细胞SIRT3蛋白水平降低,而SSd升高细胞SIRT3蛋白水平。以上数据提示,SSd可上调SH-SY5Y细胞的SIRT3的表达水平。5. SIRT3介导SSd保护SH-SY5Y细胞对抗MPP+的毒性。我们采用小分子干扰RNA (siRNA)来进一步明确SIRT3是否介导SSd的细胞保护作用。使用siRNA后,SH-SY5Y细胞中SIRT3的mRNA和蛋白水平均明显降低。实验结果提示,SSd不能保护经siRNA处理细胞对抗MPP+的损害作用。另外,SSd也不影响SIRT3基因敲除的SH-SY5Y细胞的自由基产生和细胞凋亡。以上结果提示,SIRT3敲除逆转了SSd对SH-SY5Y细胞的保护作用。结论：SSd对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞具有神经保护作用,机制可能为上调SH-SY5Y细胞SIRT3的表达水平。