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粘虫Mythimna separata隶属于鳞翅目(Lepidptera)夜蛾科(Noctuidae),主要危害玉米、小麦和水稻三大主要粮食作物,是治理虫害工作中的重点关注对象。粘虫是一种典型的远距离迁飞害虫,其幼虫存在种群密度依赖性行为,进而影响种群迁飞行为的分化。嗅觉在粘虫密度依赖性行为活动中起着至关重要的作用。气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)是昆虫通过嗅觉参与环境中化学信息物质识别的重要嗅觉相关蛋白。因此,开展粘虫气味结合蛋白的研究对阐明昆虫嗅觉机制具有一定的理论意义,同时为嗅觉响应种群密度调控种群迁飞行为的分子机制提供基础资料,进一步为农业害虫的专一性防治提供理论数据。本研究基于粘虫5龄幼虫转录组数据,鉴定并获得了12条粘虫幼虫气味结合蛋白(OBPs)unigenes序列。利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术,建立了两种生活型(散居型:1头/瓶;群居型10头/瓶)粘虫OBPs的表达模式。根据OBPs的表达模式,选取OBP6与OBP11作为候选基因,利用RACE-PCR技术克隆了候选基因全长c DNA序列并进行了生物信息学分析,建立了OBP6与OBP11基因的时空表达模式。运用植物介导昆虫RNAi技术,探究了OBP6与OBP11基因对粘虫觅食选择行为的影响。1.两种生活型粘虫5龄幼虫转录组数据库的构建。采用RNA-seq技术对两种生活型粘虫5龄幼虫进行高通量转录组测序并构建c DNA文库。所有样品的碱基正确率(Q20)高于98%,GC含量在51.29%-53.04%之间,测序结果可靠,并获得粘虫58 094条unigenes。与Nr、Swissprot、KOG和Kegg四大数据库进行相似性搜索和比对,共注释了30 184条unigenes。2.OBPs的鉴定及其在两种生活型粘虫中的表达模式。1)通过对转录组数据库进行筛选和验证,获得与气味结合蛋白相关基因12条,分别命名为OBP1-OBP12。利用RT-q PCR技术检测了OBPs的表达水平,实验结果表明,12个OBP基因在粘虫幼虫头部和表皮均有表达。OBP1、OBP3、OBP4、OBP6、OBP7、OBP8、OBP9和OBP11在头部的表达量显著高于表皮(P<0.05),OBP2、OBP5、OBP10和OBP12在表皮的表达量显著高于头部(P<0.05)。OBP1、OBP3、OBP4、OBP6、OBP7、OBP8、OBP9和OBP11在散居型粘虫头部的表达量显著高于群居型(P<0.05),OBP2、OBP5、OBP10和OBP12在散居型与群居型粘虫头部的表达量无显著差异;OBP3、OBP5、OBP8、OBP10和OBP12在散居型粘虫表皮的表达量显著高于群居型,OBP2在群居型粘虫表皮的表达量显著高于散居型(P<0.05),OBP1、OBP4、OBP6、OBP7、OBP9和OBP11在散居型与群居型粘虫表皮的表达量无显著差异。2)粘虫OBPs系统发育树的构建。利用MEGA7.0采用Neighbor-joining(邻接法)对粘虫和其他12种鳞翅目昆虫共42个OBPs进行系统发育树构建。结果显示,粘虫的OBPs和其他鳞翅目昆虫的OBPs一样,在各个分支中均有出现,没有出现基因成簇聚集现象,表明这13种物种可能有共同祖先。3.OBP6与OBP11基因全长c DNA序列的克隆及生物信息学分析。通过RACE-PCR技术,克隆获得OBP6与OBP11基因全长c DNA序列。OBP6基因5’-RACE和3’-RACE片段分别为750 bp和600 bp左右,然后与OBP6 unigene序列拼接获得全长c DNA序列为1 028 bp,起始密码子ATG位于第211-213位核苷酸,终止密码子TAA位于第924-926位核苷酸,开放阅读框长714 bp,编码237个氨基酸肽链,该肽链第1-19位氨基酸(MNNKVFVLVFLTYMSLAAAS)为信号肽区,第5-23位氨基酸为跨膜区域。OBP11基因5’-RACE和3’-RACE的片段分别为600 bp和600 bp左右,然后与OBP11 unigene序列拼接获得全长c DNA序列为912 bp,起始密码子ATG位于第50-52位核苷酸,终止密码子TAA位于第466-468位核苷酸,开放阅读框长417 bp,编码138个氨基酸肽链,该肽链第1-17位氨基酸(MKSFVVFCLVLVVGVYAN)为信号肽区,第2-19位氨基酸为跨膜区域。OBP6与OBP11均属于小分子蛋白,相对分子量分别为26.299 k Da和14.978 k Da。对OBP6与OBP11进行蛋白质三级结构预测,结果显示,它们的高级结构主要由α螺旋和β折叠组成,并由二硫键将α螺旋连接起来共同支撑着蛋白的三级结构。对OBP6与OBP11的保守结构域鉴定发现,两蛋白均属于气味结合蛋白家族(odorant binding protein family)。同源序列比对表明,OBP6与双委夜蛾Athetis dissimilis OBP相似度达65.69%,OBP11与球菜夜蛾Agrotis ipsilon OBP5基因相似度达73.17%。因此,可以确定克隆获得的粘虫OBP6与OBP11基因序列为完整的基因序列。4.OBP6与OBP11基因的表达模式。(1)OBP6与OBP11基因在幼虫口器各组成部分及触角的表达模式。通过RT-q PCR技术,检测OBP6与OBP11基因在粘虫5龄幼虫上颚、下颚、上唇、下唇、舌和触角的m RNA表达水平。实验结果表明,OBP6与OBP11基因在各组织中均有表达且表达量存在差异。OBP6基因在上唇表达量显著高于其他组织(P<0.05),触角次之,舌表达量最低;OBP11基因在上颚表达量显著高于其他组织(P<0.05),下唇次之,舌表达量最低。(2)OBP6与OBP11基因在两种生活型粘虫幼虫的表达。通过RT-q PCR技术,检测两种生活型4龄、5龄和6龄粘虫幼虫OBP6与OBP11基因m RNA的表达水平。实验结果表明,散居型4龄、5龄和6龄幼虫OBP6基因m RNA表达量均显著高于群居型(P<0.05),在两种生活型粘虫中OBP6基因m RNA水平随幼虫龄期的增长先上升后下降;散居型4龄、5龄和6龄幼虫OBP11基因m RNA表达量均显著高于群居型(P<0.05),在两种生活型粘虫中OBP11基因m RNA水平随幼虫龄期的增长而下降。5.采用寄主植物介导昆虫RNAi技术对OBP6与OBP11基因功能进行初步验证。1)玉米介导粘虫RNAi体系的建立。根据OBP6与OBP11基因序列确定其干扰片段,并设计5’端带有Bam HI、Kpn I酶切位点的特异性引物,利用PCR技术克隆干扰片段。以p TRV2为RNA表达载体,分别将426 bp OBP6和413 bp OBP11 c DNA干扰片段与p TRV2进行重组,形成p TRV2-OBP6和p TRV2-OBP11重组质粒。通过农杆菌GV3101介导,将转化有p TRV2-OBP6、p TRV2-OBP11和p TRV2-GFP(阴性对照质粒)重组质粒菌液分别于p TRV1质粒菌液按1:1比例混合,通过真空渗透法转化玉米胚芽,使玉米表达OBP6-ds RNA、OBP11-ds RNA和GFP-ds RNA。通过饲喂粘虫含有OBP6-ds RNA、OBP11-ds RNA和GFP-ds RNA的玉米植株,测定粘虫头部OBP6与OBP11基因m RNA表达量的变化及粘虫觅食选择行为。实验结果表明,空白组和阴性对照组相比,OBP6与OBP11基因m RNA表达量无显著差异,而饲喂OBP6-ds RNA和OBP11-ds RNA的实验组4龄和5龄幼虫OBP6和OBP11转录水平均显著下调,说明玉米介导粘虫RNAi产生沉默效果。2)利用Y型嗅觉仪探究OBP6与OBP11基因对粘虫觅食选择行为的影响。记录空白组、阴性对照组和实验组各10只5龄试虫在100次重复试验中对玉米气味源和空气气味源的选择行为,利用公式计算玉米选择率。实验结果表明,空白组(选择率为61.8%)和GFP-ds RNA阴性对照组(选择率为64.8%)对玉米气味具有显著选择行为(P<0.05),饲喂表达OBP6-ds RNA(选择率为55.6%)和OBP11-ds RNA(选择率为55.9%)玉米植株的实验组对玉米气味没有显著选择行为(P>0.05)。综上所述,本研究基于两种生活型粘虫5龄幼虫高通量测序数据筛选了粘虫气味结合蛋白基因(OBPs),建立其表达模式和系统发育关系。以OBP6与OBP11作为候选基因,克隆其全长c DNA序列并分析其时空表达特性。采用寄主植物介导昆虫RNAi技术构建了粘虫RNAi体系,并通过Y型嗅觉仪探究OBP6与OBP11基因对粘虫觅食选择行为的影响。根据研究结果我们推测粘虫OBP6与OBP11基因参与玉米气味选择行为,有可能响应粘虫种群密度依赖性行为。