社会竞争的增大和生活节奏的加快使得现代人承担的压力越来越大,脑力工作的负担也不断增加,需更多的血液和氧气才能保证大脑的顺畅工作。当进行高空、潜水等作业或患某些疾病时,同样会遇到各种情况的缺氧。缺氧可引起机体一系列生理代偿反应,如心率增加,血流动力学改变,肺动脉高压、能量代谢障碍等,尤其是其可致心肌受损、脑功能下降。因此采用一些抗缺氧的药物改善机体供氧和能量状态,对提高机体在缺氧条件下的生活质量和活动能力有非常重要的意义。研究表明部分西药对缺氧引起的症状具有一定的缓解作用,但由于这些药物的副作用很大,导致其实际使用受到很大限制。另根据报道,人参、红景天、银杏提取物等中药具有提高机体缺氧耐受作用,但它们大多数都属于贵重中药或藏药,分布局限,资源很少而且价格昂贵,因此也难以在大范围内推广使用。马齿苋(Portulaca oleracea L.)为马齿苋科马齿苋属植物,又名马齿草、五行草、长命菜、九头狮子草、酸味菜、蚂蚁菜等,我国南北各地均产,广布全世界温带和热带地区,为药食两用植物。据《本草纲目》记载,临床可用于“散血消肿,利肠滑胎,解毒通淋,治产后虚汗”。马齿苋含有丰富的脂肪酸、挥发油、多糖、氨基酸、和矿物质等多种具有药用价值的化学成分,这使得马齿苋的开发具有很好的物质基础。课题组前期研究发现马齿苋水提物能够明显延长小鼠在密闭缺氧环境中的生存时间和氰化钾中毒后的生存时间,提高缺氧小鼠的无氧酵解关键酶丙酮酸激酶、磷酸果糖激酶的活性和组织细胞ATP水平,马齿苋还能够促进缺氧小鼠大脑皮层HIF-1α表达。但是马齿苋水提物的成分非常复杂,一些无效的杂质含量太高这给后期的开发研究工作带来很大的困难。为了进一步分离出马齿苋抗缺氧的有效活性部位,并且根据中药筛选活性成分的程序观察其体内外抗缺氧效果,探索其抗缺氧成分具体的作用机制,我们进行了如下的研究。目的进一步筛选马齿苋抗缺氧作用的主要活性部位,并通过体内与体外实验观察马齿苋提取物对缺氧小鼠/神经细胞的保护作用,阐明马齿苋提取物缺氧保护作用的药理机制,为将药食两用植物马齿苋开发成为功能因子明确的抗缺氧保健食品或药物提供实验依据。方法1.马齿苋抗缺氧活性部位的筛选及量效关系研究1.1马齿苋各提取部分制备马齿苋药材,8倍量80%乙醇流提取2次,每次1小时。合并提取液,减压除乙醇,加水至1g(生药)/mL,10%NaOH调节pH6.5-7.0,5000rpm离心,得沉淀,水洗,离心,干燥；上清液上大孔树脂,吸附,分别用水、50%乙醇和95%乙醇洗脱。将总提液、上清液、水洗脱液、50%乙醇洗脱液、95%乙醇洗脱液、沉淀混悬液各部分制成溶液(生药浓度为1 g／mL),待用。1.2常压密闭缺氧暴露实验健康雄性ICR小鼠,按体重随机分为溶剂对照组,人参皂苷水溶液组,马齿苋各提取部分给药组：总提液、上清液、水洗脱液、50%乙醇洗脱液、95%乙醇洗脱液、沉淀混悬液。每只小鼠每天定时灌喂给药0.5ml(折合含生药1g),连续一周,于给药前、给药第四天、给药后各称体重一次,动物于末次给药后1小时放入盛有10g钠石灰的200ml广口瓶内(每瓶1只),用凡士林涂抹瓶口,密封使之不漏气,外用保鲜膜再次封住瓶口,从密封即刻计时,以呼吸停止为指标,记录小鼠因缺氧窒息死亡的时间。1.3有效部位不同剂量常压密闭缺氧暴露小鼠生存时间实验健康雄性ICR小鼠,按体重随机分为溶剂对照组,人参皂苷水溶液组,马齿苋沉淀低、中、高剂量(折合含生药0.5、1.0、2.0g)。小鼠处理以及缺氧方法同前。1.4亚硝酸钠中毒生存时间实验小鼠分组情况以及给药方式同实验3。末次给药后1小时,各组小鼠均尾静脉注射亚硝酸钠800m g/kg,观察小鼠存活时间。1.5 GC-MS方法分析马齿苋活性部位的化学成分取马齿苋活性部位适量,置有塞的容量瓶中,加100倍体积二氯甲烷超声提取0.5h,以二氯甲烷补足损失的重量,取提取液少量以0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液1.0μL进样,分流比30：1,所得各组分的质谱数据入NIST数据库进行检索,同时通过面积归一化法从总离子流图中计算各成分的相对百分含量。2.马齿苋提取物对缺氧神经保护作用研究2.1含药血清的制备：根据文献每日两次给予SD大鼠(体重200±10g)马齿苋提取物水溶液灌喂,对照组给予同体积的生理盐水及人参皂苷。灌胃剂量根据中药药理研究方法学动物体表面积等剂量发换算,低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组大鼠6只,雌雄兼用。连续十次,于最后一次灌药后1h(灌药前禁食、不禁水12h),心脏采血置4℃冰箱过夜,1000r/min离心10min,吸取上层血清,经56℃30min灭活,无菌过滤后,置-80℃冰箱保存备用。2.2细胞实验：选用PC-12细胞及原代培养的新生大鼠皮层神经细胞,通过通入低氧混合气体及氯化钴刺激模拟化学缺氧的方法建立缺氧神经细胞模型,同时在细胞培养基中加入不同浓度的马齿苋提取物含药血清,经不同条件的缺氧暴露(0% 02)后用CCK-8法测定细胞活性,用试剂盒测定培养上清中LDH含量,用特异性底物法测定细胞裂解液中caspase-3活性,用流式细胞法检测细胞凋亡数目。2.3动物实验：健康雄性ICR小鼠体重20-24g,购自中英合资上海西普尔-必凯实验动物有限公司。每笼饲养5只,自由饮食和进水,适应饲养4天,按体重随机分组进行实验,饲养条件同前。共30只小鼠平均分为3组,分别为溶剂对照组,人参皂苷水溶液组,马齿苋提取物组(2g／d)。每只小鼠每天定时灌喂给药0.5ml,连续一周,于给药前、给药第四天、给药后各称体重一次,动物于末次给药后1小时,将动物置于通入8%02、92%N2混合气体的医用氧舱,同时在氧舱中放入碱石灰以去除CO2影响。小鼠放入氧舱后,开始大气流洗舱,约10min后恒定气流(0.2ml/min)。缺氧暴露6,12,24后取出小鼠,按实验要求取材。缺氧暴露后即刻处死动物,取部分小鼠分离大脑皮层组织检测组织匀浆中caspase-3活性情况；另取部分小鼠分离脑组织同时分离血清,按常规病理检测方法测定脑组织损伤情况,并采取单盲法进行病理评分；用普通酶联免疫吸附法测定血清中神经元特异性烯醇化酶的含量。3.马齿苋提取物缺氧神经保护作用机制研究3.1细胞实验：原代神经细胞缺氧采用0%O2、5%CO2用N2平衡混合气体培养6h。分组情况如下：(1)正常对照组(Control):不缺氧组；(2)缺氧组(Hypoxia):采用0%02、5%CO2用N2平衡混合气体培养6h；(3)马齿苋处理组(Hypoxia+PO):缺氧前,马齿苋预处理1h,再进行缺氧处理。(4)LY294002 (PI3K特异性抑制剂)+马齿苋处理+缺氧(Hypoxia+PO+LY):马齿苋处理1h后继续用20μM/LLY294002处理1h,再进行缺氧处理。CCK-8法测定细胞的活性,Western blot法检测HIF-1α、P-AKT、AKT含量3.2动物实验：健康雄性ICR小鼠体重20g-24g,购自中英合资上海西普尔-必凯实验动物有限公司。每笼饲养5只,自由饮食和进水,适应饲养4天,按体重随机分组进行实验。将小鼠分为4组：(1)正常对照组(Control):不缺氧组；(2)缺氧组(Hypoxia):(3)马齿苋处理组(缺氧+马齿苋低、中、高剂量)：每只小鼠每天定时灌喂给药0.5ml(折合含生药2g),连续一周,于给药前、给药第四天、给药后各称体重一次,动物于末次给药后1小时,将动物置于通入8% 02、92% N2混合气体的医用氧舱,同时在氧舱中放入碱石灰以去除C02影响。小鼠放入氧舱后,开始大气流洗舱,约10mmin后恒定气流(0.2ml/min)。分别缺氧暴露12h后每组取出小鼠按实验要求取材,置于低温冰箱保存备用,以进行生化和分子生物学指标测定。常规方法检测大脑皮层磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性和ATP含量,Western blot法检测HIF-1α、P-AKT含量。4.数据的统计与处理实验数据采用SPSS10.0统计软件包采用one-way ANOVA检验进行数据分析,实验数据以平均数±标准差(X±SD)表示,显著性水平为P<0.05。结果1.马齿苋抗缺氧活性部位的筛选及量效关系1.1马齿苋提取物对常压密闭缺氧窒息小鼠生存时间的影响与人参皂苷组比较,马齿苋各提取部位中马齿苋沉淀部位(以后本文中称为马齿苋提取物)能够明显提高动物在缺氧环境中的生存时间(p<0.01),结果表明：马齿苋沉淀有明显的抗缺氧作用,为马齿苋抗缺氧活性部位。1.2马齿苋提取物不同剂量对常压缺氧、亚硝酸钠小鼠生存时间的影响马齿苋提取物不同剂量对单纯常压缺氧的小鼠有延长生存时间的作用,而且随着剂量的增加,生存时间略有增加。而且对亚硝酸钠化学缺氧小鼠的生存时间也有明显的延长作用。1.3马齿苋提取物抗缺氧活性部位成分分析采用GC-MS方法对马齿苋活性部位的化学成分进行分析,经毛细管色谱分析分离出53个峰。对总离子流图中的各峰经质谱扫描后得到质谱图,经计算机质谱数据库检索各色谱峰的质谱裂片图,并结合相关文献,分别对各色谱峰加以确认,共确认出其中44种成分,按面积归一化法确定各组分相对含量。可见其中主要的有效成分为萜类以及有机酸类等。2.马齿苋提取物对缺氧神经保护作用2.1马齿苋提取物含药血清对缺氧或CoCl2刺激PC-12细胞和原代培养神经细胞活性的保护作用马齿苋提取物可以增强缺氧条件下PC-12细胞及原代培养的新生大鼠皮层神经细胞的活性,并降低细胞培养上清液中LDH的活性；在同样缺氧或氯化钴刺激条件下,随着药物浓度的增加对缺氧细胞的保护作用增强；马齿苋提取物可以减少缺氧条件下PC-12凋亡细胞数目。2.2马齿苋提取物对缺氧小鼠脑组织的保护作用动物实验结果显示,随缺氧时间的延长,小鼠脑组织病理损伤评分逐渐增加,同时小鼠血清中神经元特异性烯醇化酶(NSE)活性增高,缺氧暴露12,24小时,NSE活性较未缺氧组活性增长显著(P<0.05),表明小鼠脑组织损伤逐渐加重。给予人参皂苷可以相对降低缺氧小鼠血清中NSE含量；与同样缺氧暴露条件下对照组相比,给予马齿苋提取物可以减轻缺氧暴露条件下小鼠脑组织的损伤,降低病理损伤评分；降低缺氧小鼠血清中NSE活性(缺氧暴露12h条件下,药物干预组小鼠血清中NSE含量为同等缺氧暴露条件下对照组该酶含量的96%76%)；降低缺氧小鼠皮层组织中caspase-3的活性。3.马齿苋提取物缺氧神经保护作用机制研究3.1马齿苋提取物对缺氧神经元细胞的活性影响CCK-8实验表明,缺氧(0%02,6h)条件下神经元细胞的活性较不缺氧组细胞明显下降,有统计学意义(p<0.05)；马齿苋预处理组细胞缺氧后与缺氧组细胞比较活性明显升高(p<0.05)；而马齿苋与LY294002共同处理的细胞缺氧后又比单独用马齿苋与处理的活性有所下降且有统计学意义.(p<0.05)3.2马齿苋提取物对缺氧神经元细胞P-AKT、AKT蛋白的影响大量资料证实,LY294002为PI3K特异性抑制剂,它可以阻断PI3K的下游靶蛋白Akt的磷酸化表达。实验结果显示,与正常组细胞比较,缺氧后细胞磷酸化Akt水平明显升高,马齿苋预处理后其磷酸化水平进一步提高,而LY294002处理后,马齿苋的这种提高Akt磷酸化的作用被阻断,磷酸化Akt蛋白表达水平明显下降。而马齿苋提取物与LY294002均未改变细胞Akt总蛋白水平。3.3马齿苋提取物对缺氧神经元细胞HIF-la表达的影响常规培养的细胞HIF-1a迅速降解,故较少有蛋白表达。缺氧后,细胞HIF-1α表达稳定,Western blot结果显示HIF-1α蛋白表达量明显增加,马齿苋提取物可进一步激活HIF-1α的表达,而P13K特异性抑制剂LY294002抑制了HIF-1α的表达,蛋白表达水平较马齿苋处理组明显减少(p<0.05)。3.4马齿苋提取物对缺氧小鼠皮层HIF-1α、P-AKT的影响常氧组基本上没有检测到HIF-1α,而缺氧暴露各组小鼠大脑皮层HIF-1α含量均明显增加,与单纯缺氧对照组相比,马齿苋提取物各个剂量组对缺氧小鼠大脑皮层HIF-1α的含量明显增高(p<0.05)。而P-AKT含量的变化类似与HIF-la的变化,常氧组P-AKT含量较低,缺氧后P-AKT含量明显升高,但是给予马齿苋提取物不同剂量进一步提高了P-AKT的含量。3.5马齿苋提取物对缺氧小鼠大脑皮层磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响：实验结果显示,8%氧气常压缺氧使各组小鼠大脑皮层PFK、PK和LDH的活性都明显增强。而灌喂不同剂量马齿苋提取物使缺氧小鼠大脑皮层PFK、PK和LDH的活性有不同程度的进一步提高。而且随着剂量增加这些酶的活性也相应增强。3.6马齿苋提取物对缺氧小鼠大脑组织三磷酸腺苷(ATP)含量的影响实验结果显示,缺氧使各组小鼠大脑皮层细胞ATP含量都显著下降,而马齿苋提取物组小鼠大脑皮层细胞ATP含量的下降幅度与单纯缺氧组小鼠比较有明显减小(P<0.05),而且随着剂量的增加,ATP含量的下降幅度进一步减小。结论1.本研究通过进一步对马齿苋抗缺氧的活性部位进行筛选,得到沉淀部位可以延长常压缺氧小鼠生存时间。而且马齿苋提取物不同剂量对常压缺氧、亚硝酸钠中毒小鼠生存时间的影响小鼠有延长生存时间的作用,而且随着剂量的增加,缺氧生存时间有所延长,其抗缺氧的有效成分可能为萜类以及有机酸类等。2.体外实验发现,马齿苋提取物可以缓解缺氧或氯化钴刺激条对PC-12细胞、以及原代培养神经元的损伤,提高细胞活性,减少细胞凋亡,降低细胞培养上清中LDH的活性。体内实验发现,马齿苋提取物可以减轻缺氧小鼠脑组织损伤程度,降低病理学评分,降低缺氧小鼠大脑皮层capase-3活性,降低小鼠血清中神经元特异性烯醇化酶活性。通过体内／体外实验证明马齿苋提取物对缺氧神经组织／细胞具有一定保护作用；3.马齿苋提取物可以激活缺氧诱导神经元细胞的PI3K/AKT的磷酸化进而诱导HIF-1α蛋白表达,给予PI3K特异性抑制剂LY294002,降低马齿苋提取物对缺氧神经元的保护效应,磷酸化Akt、HIF-1α蛋白表达水平也明显下降。马齿苋提取物可以提高缺氧小鼠皮层HIF-1α、P-AKT的表达,进一步激活磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶,增加缺氧小鼠皮层的ATP水平,表明马齿苋提取物对缺氧的保护作用可能与激活PI3K/AKT的磷酸化进而诱导HIF-1α表达有关。综上所述,本研究发现马齿苋提取物具有提高缺氧小鼠的生存时间,保护缺氧PC-12细胞以及神经元的作用,其机制可能与激活PI3K/AKT的磷酸化进而诱导HIF-1α的表达,进一步促进HIF-1调控的下游基因如PFK、PK和LDH等的表达有关。