蛋鸡的产蛋性能主要取决于卵巢中生殖细胞以及卵泡的生长发育水平,而卵泡发育的调控是蛋禽繁殖的核心问题。家禽卵巢中只有不超过5%的卵泡可完成发育过程,最后成熟排卵。卵母细胞被排出后,遗留下来的组织被称为排卵后卵泡(postovulatory follicle,POF),在完成排卵之后,POF开始逐渐退化。而另外超过95%没有完成发育至成熟排卵的卵泡,最终都发生退化,这部分卵泡称闭锁卵泡(atretic follicle)。POF与闭锁卵泡组成了家禽卵巢中两种退化卵泡(regressed follicle)。本实验以海兰白蛋鸡为研究对象,一方面以研究POF调节蛋鸡卵泡发育的分子机制,另一方面探究延缓卵泡闭锁的方法。利用POF调节成鸡卵泡发育和减缓卵泡闭锁的双重措施,使蛋鸡的生殖细胞得以充分利用,为退化卵泡对蛋鸡产蛋性能调节作用提供理论依据。1.凋亡与自噬活动参与蛋鸡POF的退化哺乳动物成熟卵泡排卵后形成黄体,通过分泌高水平的孕酮(progesterone,P4)来调节子宫内膜的发育、胚胎附植以及早期胚胎的发育。然而,鸟类的卵泡排卵后不形成黄体,仅作为POF而逐渐退化。目前,POF的功能和退化机制尚不清楚。因此,本课题着手研究凋亡和自噬活动的变化是否参与POF的退化。通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)、油红O和透射电镜(transmission electron microscope,TEM)等形态学观察以及P4水平检测等方法,结果发现POF结构和分泌功能退化的最大程度发生于POF3。TUNEL法检测结果表明,POF颗粒层的退化程度不同于膜层,相比于膜层,颗粒细胞可维持更久的生物学活性。重要的是,相对于其他阶段的POFs,线粒体凋亡和内质网应激的相关基因和蛋白在POF3的颗粒层中的表达量达到最高值。此外,自噬标志性蛋白Beclinl主要表达于POF的膜层,同时随着POF的退化,LC3βII和Beclinl在POF膜层的表达上调,而自噬转运蛋白p62表达下调,说明自噬发生于POF的膜层中。以上结果提示:POF颗粒层的退化与线粒体凋亡和内质网应激相关,而POF膜层的退化可能是半胱天冬氨酸酶(caspase)介导的细胞凋亡和Beclin1介导的自噬联合作用产生的结果。2.POF通过PGE2-EP2信号促进蛋鸡等级前卵泡生长鸟类的POF是一个特殊的结构,对于其功能基本上还不明确。有报道指出,结扎或者摘除蛋鸡的POF之后,会影响蛋鸡的产蛋能力和就巢能力。这说明蛋鸡的POF可作为一个内分泌腺,分泌某些激素或者细胞因子来发挥作用。本实验通过建立POF培养、POF与等级前卵泡共培养、POF颗粒细胞培养、POF颗粒细胞与等级前卵泡共培养和等级前卵泡培养等5种培养模型,并通过HE、免疫组化和免疫荧光染色,免疫印记(Western blot,WB)、酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和qRT-PCR等方法检测POF对等级前卵泡生长发育的影响。结果显示,两种前列腺素合成酶(COXl和COX2)、芳香化酶P450(cholesterol side-chain cleavage enzyme,CYP11A1)和类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory proteins,STAR)主要表达于POF的颗粒细胞。同时,最大的排卵后卵泡(POF1)分泌的前列腺素PGE2和PGF2α显著高于最大的排卵前卵泡和其他POF。通过共培养实验发现POF1和POF1的颗粒细胞都能促进小白卵泡(等级前卵泡的一个阶段,small white follicle,SWF)的外膜层细胞增殖;同时PGE2也能促进SWF外膜层细胞的增殖。POF1对SWF的增殖作用可被前列腺素合成酶的抑制剂吲哚美辛所抑制,但是这种抑制作用并不能阻断外源性添加PGE2的促增殖作用。另外,PGE2的促增殖能力受EP2的拮抗剂TG6-10-1所拮抗,说明POF1可通过PGE2-EP2信号促进SWF外膜层细胞的增殖,从而促进等级前卵泡的生长和发育。3.蛋鸡等级前卵泡生长发育和闭锁相关基因的初筛家禽生产中,闭锁卵泡的数量直接影响产蛋率的高低,目前关于家禽卵泡闭锁的机理尚不清楚,本实验旨在探索导致卵泡闭锁的可能原因。选取小白卵泡、小黄卵泡与大小接近的闭锁小黄卵泡,通过HE染色观察形态学差异,并通过qRT-PCR的检测相关基因表达。结果表明:闭锁小黄卵泡(atretic small yellow follicle,ASYF)与正常小黄卵泡(small yellow follicle,SYF)相比,颗粒层增生变厚,但细胞松散,紧密连接蛋白相关基因E-Cadherin显著下调,抑凋亡基因Bcl2极显著下调,凋亡基因caspase-3和caspase-9显著上调;检测激素合成酶得知,闭锁卵泡与正常卵泡相比,类固醇激素合成关键酶基因Cyplla1、Hsd3b2、Cyp17a1和Cyp19a1的表达均下调,前列腺素合成相关基因COX1和COX2表达均极显著升高;检测激素受体得知闭锁卵泡与正常卵泡相比,促性腺激素受体FSHR和LHR、类固醇激素ERβ相关受体基因表达量极显著升高,前列腺素相关受体EP2、EP4和FP表达量显著升高,但EP3表达量显著降低。此外,闭锁卵泡与正常卵泡相比,FGFR1和VEGFR1基因的表达量显著降低,但TGFβR1显著升高;SYF与小白卵泡(small white follicle,SWF)相比,BMPR1β、BMPR2、TGFβR1、FGFR1、VEGFR1和VEFGR2的表达量均显著升高,但VLDLR表达量显著降低。结果提示,闭锁卵泡的紧密连接蛋白受到破坏,闭锁进程由caspase通路介导的;对于闭锁卵泡,类固醇激素的合成能力逐渐丧失,促性腺激素和类固醇激素受体表达上调有助于延缓卵泡闭锁的进程;前列腺素合成酶和相关受体表达上调可能与闭锁卵泡的退化与再吸收相关,闭锁卵泡合成前列腺素的能力上升,可能通过自分泌作用于EP2、EP4和FP受体介导闭锁卵泡的退化与再吸收进程。4.bFGF促进蛋鸡等级前卵泡生长发育与卵黄沉积机制的研究此前的实验表明,随着卵泡发育,FGFR1的mRNA表达量上升,而VLDLR的mRNA表达量下降。蛋鸡卵母细胞中卵黄物质的主要成分包括极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)和卵黄蛋白原(vitellogenin,VTG),VLDL在肝脏合成,通过其受体VLDLR介导经内吞作用进入卵母细胞。本实验通过检测VLDLR在不同阶段卵泡中的表达,使用碱性成纤维因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)处理蛋鸡的SWF,并通过免疫荧光、WB和qRT-PCR等方法检测bFGF对等级前卵泡生长发育及卵黄沉积的影响。结果显示,VLDLR主要表达于等级前卵泡和排卵前卵泡的颗粒细胞上,且随着卵泡的发育,VLDLR的表达量下降。通过添加FGFR1的拮抗剂SU5402发现,bFGF通过FGFR1-AKT信号促进SWF外膜层的增殖,且bFGF能促进SWF外膜层的血管生成。此外,bFGF能抑制SWF的VLDLR和p-ERK的表达,通过联合阻断FGFR1和PPARγ,发现PPARγ也可以抑制SWF中VLDLR的表达。结果说明,bFGF一方面能促进SWF膜细胞增殖和血管生成,另一方面,能抑制颗粒细胞中VLDLR的表达,从而促进蛋鸡卵泡发育和卵母细胞卵黄的沉积。综上所述,通过比较不同阶段POF的退化程度,发现POF颗粒层的退化与线粒体凋亡和内质网应激相关,而POF膜层的退化可能是caspase介导的凋亡和Beclinl介导的自噬联合作用产生的结果;通过建立POF与SWF和POF的颗粒细胞与SWF的共培养模型,发现POF可通过PGE2-EP2信号提高SWF外膜层细胞的增殖活性,从而促进等级前卵泡的生长和发育;同时,通过比较SWF、SYF与ASYF,筛选出促进卵泡生长发育和抑制闭锁的相关基因;通过bFGF处理,发现bFGF对蛋鸡等级前卵泡生长发育及卵黄沉积具有促进作用。以上研究结果不仅为退化卵泡衰退机制及其对调节蛋鸡后续卵泡发育的作用提供了理论基础,而且为提高蛋鸡产蛋性能措施的研究提供了参考作用。