【摘 要】
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目的:生物人工肝系统(bioartificial liver,BAL)应用过程中临床肝衰竭患者血液中的毒性物质和药物浓度对BAL肝细胞的生存影响巨大,因此,提高肝细胞的抗毒性能力可以促进BAL的应用效能。有研究表明,可以通过改造能够应用于生物人工肝系统(BAL)的人肝细胞株增强其抗毒性能力。超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)是抗氧化应激的重要基因,是清除细胞
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目的:生物人工肝系统(bioartificial liver,BAL)应用过程中临床肝衰竭患者血液中的毒性物质和药物浓度对BAL肝细胞的生存影响巨大,因此,提高肝细胞的抗毒性能力可以促进BAL的应用效能。有研究表明,可以通过改造能够应用于生物人工肝系统(BAL)的人肝细胞株增强其抗毒性能力。超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)是抗氧化应激的重要基因,是清除细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的重要基因,并且在细胞药物代谢过程中发挥着一定的作用。因此,本研究中我们深入探究过表达SOD2对肝细胞药物代谢方面的影响,并通过基因芯片分析SOD2过表达引发肝细胞药物代谢能力改变的原因,进一步验证和阐明其分子机制。方法:1.用SOD2表达较低的肝细胞株构建SOD2过表达稳定转染的细胞株(HL7702-SOD2和MHCC97H-SOD2),以阴性对照组(HL7702-NC和MHCC97H-NC)作为对照,进行基因芯片分析,并经过筛选分析,得到差异较大有统计学意义的药物转运蛋白ABCC2,在两株SOD2高表达的细胞Hep G2和Huh7中进行si RNA瞬转,敲低细胞中SOD2,对芯片结果进行反向验证;2.将SOD2过表达细胞株和SOD2敲低的细胞株进行不同浓度(0nM、30 nM、60 nM)的药物紫杉醇(paclitaxel,PTX)处理48h,通过药物外排实验(efflux实验)验证SOD2对细胞药物外排的影响;3.对芯片结果进行共表达分析,发现长链非编码RNA(lnc RNA)CLCA3P可能参与SOD2对ABCC2的调控,一方面,WB和q PCR方法验证SOD2对lnc RNA CLCA3P的正向调控;另一方面,构建CLCA3P过表达质粒瞬时转染和合成小干扰RNA敲低CLCA3P,经WB和q PCR探讨lnc RNA CLCA3P表达水平的变化对ABCC2表达的影响;4.利用数据库预测ABCC2的启动子区域,再通过转录因子预测网站预测分析可能参与CLCA3P对ABCC2调控的转录因子以及可能的结合位点,运用RIP技术证明CLCA3P与预测转录因子之间的直接相互作用,同时,构建ABCC2启动子全长和截断片段的荧光素酶报告质粒,双荧光素酶报告分析预测转录因子对ABCC2启动子活性的影响,并通过突变预测的结合位点,运用双荧光素酶报告和CHIP技术验证该预测位点。结果:1.基因芯片结果提示,在肝脏细胞中过表达SOD2,ABCC2表达水平也会随着提高,这一结果也通过WB和q PCR技术得到进一步的验证;同时,在SOD2被敲低的两组细胞中,ABCC2的表达呈现出下降的趋势;2.不同浓度(0nM、30 nM、60 nM)的PTX处理48h后,SOD2过表达的两组细胞药物外排的能力增强,SOD2敲低的两组细胞药物外排能力降低;3.基于基因芯片的共表达分析提示CLCA3P可能参与SOD2对ABCC2的调控,WB和q PCR结果表明肝细胞中CLCA3P水平随着SOD2表达水平改变而成正相关性的改变,而ABCC2的表达则受到lnc RNA CLCA3P的正向调控;4.数据库和转录因子预测发现CLCA3P通过可能转录因子IRF1参与对ABCC2的调控,RIP实验验证了CLCA3P与IRF1的直接结合作用,双荧光素酶报告说明的转录因子IRF1对ABCC2启动子活性有影响,并且ABCC2启动子区域(-208nt~+88nt)存在IRF1的结合活性位点,CHIP实验证明了二者之间的直接相互作用。结论:1.过表达SOD2可以提高肝细胞在药物环境中的生存能力;2.SOD2表达水平的改变正向影响肝细胞ABCC2的表达和对药物的外排能力;3.SOD2正向调控lnc RNA CLCA3P的表达,而ABCC2受CLCA3P的正向调控;4.转录因子IRF1参与CLCA3P对ABCC2的调控。
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