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第一部分人脐带间充质干细胞来源微囊泡的分离纯化目的:建立一个高效人脐带间充质干细胞来源微囊泡的分离纯化方法。方法:收集第3代至第8代间充质干细胞上清液,分别采用差速离心法,改良超速离心法,蔗糖梯度纯化法提取MVs,Bradford法蛋白定量,共聚焦显微镜及透射电镜观察MVs的形态学特征。结果:改良超速离心方法MVs的蛋白含量显著高于传统差速离心方法和蔗糖梯度纯化法,每1×106个细胞大约释放162μg左右的MVs。电镜下MVs直径介于30-200nm之间,呈单层膜、类圆形囊泡结构,中间为低电子致密物质。结论:改良超速离心法能获得高蛋白浓度的微囊泡。第二部分微囊泡对化疗损伤卵巢颗粒细胞的保护作用目的:探讨MSCs来源MVs对化疗损伤颗粒细胞的保护作用。方法:1.机械分离法分离3周SD雌性大鼠卵巢颗粒细胞,原代无血清培养,FSHR免疫荧光鉴定颗粒细胞的纯度;将PKH26标记的MVs添加入正常颗粒细胞以及顺铂损伤颗粒细胞中,6h后荧光显微镜观察MVs在颗粒细胞的定位;将不同浓度MVs与颗粒细胞共培养,确定最佳MVs作用浓度。2.实验分组:实验分为正常颗粒细胞组(GCs)、顺铂组(CTx)和顺铂+微囊泡组(MVs+CTx);MTT法检测各组细胞存活率;化学发光法检测各组培养液上清雌二醇和孕酮浓度;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测各组颗粒细胞凋亡率;实时荧光定量PCR检测各组颗粒细胞凋亡相关基因(Bax、Bcl-2、Caspase3)以及类固醇急性调节蛋白基因(St AR)的表达水平。结果:1.无血清培养的大鼠卵巢颗粒细胞生长良好,免疫荧光染色证实本研究所获颗粒细胞纯度达95%以上;MVs在共培养6h后,损伤颗粒细胞中可见红色荧光标记的MVs。2.MVs与化疗损伤颗粒细胞共培养后,颗粒细胞凋亡率明显减少,雌激素水平明显升高,颗粒细胞凋亡相关基因Caspase3的表达水平显著降低,Bcl-2与Bax比值及St AR基因表达水平显著升高,且MVs对化疗损伤颗粒细胞的保护作用呈浓度依赖性。结论:MVs能进入化疗损伤的颗粒细胞中,在体外能够减轻颗粒细胞的损伤,促进损伤颗粒细胞增殖和分泌功能的恢复。