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鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）为单股正链RNA病毒,属于黄病毒科、黄病毒属。黄病毒为了更好地在宿主细胞中复制,通过其编码的非结构蛋白以多种途径来拮抗宿主细胞产生的抗病毒免疫反应。但是,TMUV的致病机制与免疫机制尚未完全揭示。为了理解DTMUV多跨膜非结构蛋白（NS）在病毒复制及其与宿主抗病毒免疫系统的互作机理,本论文以DTMUV的实验室分离CQW1株为研究对象,探究DTMUV编码的NS2A和NS4B蛋白拮抗宿主抗病毒免疫反应机制及其跨膜区疏水性氨基酸对病毒复制的调控。1.DTMUV NS2A或NS4B抑制宿主IFN产生的分子机制首先,利用双荧光素酶报告系统和实时荧光定量PCR（RT-q PCR）实验检测DTMUV感染对鸭I、II、III型IFN的诱导情况。试验结果表明DTMUV感染能够上调鸭IFN-α、IFN-γ和IFN-λ的m RNA水平。通过IFN抗病毒试验发现,DTMUV感染能明显抑制鹅IFNs的抗病毒功能,表明DTMUV存在某种机制抑制IFN介导的抗病毒免疫反应。通过流式细胞术、双荧光素酶报告系统和RT-q PCR实验等方法,筛选可能抑制IFN信号通路的候选DTMUV非结构蛋白。结果显示:NS2A和NS4B蛋白能够呈剂量依赖方式抑制病毒诱导的IFNβ和ISRE启动子活性。以上结果表明,DTMUV编码的NS2A和NS4B蛋白可抑制宿主IFN介导的免疫反应,以抵抗宿主抗病毒免疫反应并促进自身的增殖。其次,利用双荧光素酶报告系统、RT-q PCR实验和间接免疫荧光实验（IFA）等方法分别筛选和鉴定NS2A和NS4B蛋白抑制IFN信号通路的可能靶点蛋白,并利用IFA、Nano Bi T活细胞实时蛋白相互作用技术（Nano Bi T-PPI）和免疫共沉淀实验（Co-IP）等方法进一步确认了NS2A和NS4B蛋白均可与STING蛋白发生相互作用,表明NS2A和NS4B蛋白是通过调控STING蛋白而抑制IFN的表达。为了揭示其内在机制,本研究以Nano Bi T-PPI技术观察过表达NS2A或NS4B蛋白对STING与STING同二聚化和STING与TBK1异二聚化的影响,并利用IFA和蛋白印迹实验（Western Blot,WB）分析下游TBK1的磷酸化情况,发现过表达NS2A和NS4B蛋白均明显抑制了TBK1的磷酸化。以上结果表明:NS2A和NS4B蛋白通过与TBK1竞争性结合STING,导致TBK1的磷酸化被抑制,从而阻断了信号转导致IFN表达受到抑制。2.DTMUV NS2A或NS4B与STING相互作用位点的鉴定及其对病毒复制的影响首先,利用蛋白截短表达和Nano Bi T-PPI技术探讨NS2A或NS4B蛋白与STING蛋白相互作用的区域,结果显示:NS2A蛋白C端113-143 aa区域或NS4B蛋白N端1-38aa区域可与STING蛋白发生相互作用。进一步,利用Nano Bi T-PPI技术探讨STING蛋白与NS2A和NS4B蛋白相互作用位点,结果表明NS2A蛋白的L129、N130、L139、R140、F143和NS4B蛋白的E2、M3、G4、W5、K10、D34、R36是其与STING蛋白相互作用的关键位点。其次,利用DTMUV非感染性复制子系统,构建NS2A和NS4B蛋白突变的病毒复制子,以测定复制子生长曲线;利用DTMUV感染性c DNA克隆,构建NS2A或NS4B免疫抑制位点突变的重组病毒,以测定重组病毒的生长曲线。以上结果表明,NS2A或NS4B蛋白免疫抑制位点的突变减弱了DTMUV重组病毒（r DTMUV）在BHK-21细胞上的增殖,证明病毒利用此机制促进自身增殖。进一步,本研究以体内实验考察了突变重组病毒的毒力,将病毒分别接种9日龄鸭胚和3日龄雏鸭,考察病毒对鸭胚和雏鸭的致死情况,并利用RT-q PCR实验检测雏鸭血液和脾脏中的病毒拷贝数。结果显示,NS2A L129A和NS4B W5A、D34A突变降低了病毒的鸭胚和雏鸭致死率,并改变了病毒对脾脏的嗜性和载量。3.DTMUV NS2A和NS4B蛋白拓扑结构分析及其跨膜区对病毒复制的影响为了明确多跨膜蛋白NS2A和NS4B的病毒学功能,本研究首先利用病毒感染、蛋白过表达、IFA等实验分析NS2A和NS4B蛋白的亚细胞定位。结果显示NS2A和NS4B蛋白均定位于细胞内质网上,并且与病毒ds RNA存在共定位。利用多个跨膜区分析工具（TMHMM、TMpred、HMMTOP、SOSUI、Philius、PSIPRED、TOPCONS、Poly Phobius和DAS）对NS2A和NS4B蛋白的跨膜结构进行预测分析,综合分析结果推测NS2A蛋白具有8个疏水性跨膜区,而NS4B蛋白具有5个疏水性跨膜区。随后,以体外去糖基化实验和体外蛋白酶K保护实验确定NS2A和NS4B蛋白膜拓扑结构,发现:NS2A和NS4B蛋白均只有一个横跨内质网的跨膜区TMD3。进一步,利用DTMUV的反向遗传学技术研究NS2A和NS4B蛋白跨膜区TMD3疏水性氨基酸对病毒复制的影响。利用DTMUV非感染性复制子系统和全长感染性c DNA克隆,考察病毒的复制能力及体内外生长情况、毒力、鸭胚致死率和雏鸭致病力等,并利用RT-q PCR检测病毒感染雏鸭的血液和脾脏中的病毒载量。以上结果表明,NS2A-TMD3和NS4B-TMD3跨膜区疏水性氨基酸是调控病毒复制的关键区域。综上所述,本论文揭示了DTMUV的免疫逃逸机制,即通过编码的NS2A和NS4B蛋白与TBK1竞争性结合STING蛋白而抑制TBK1磷酸化,从而阻断下游IFN产生。本论文确定了NS2A和NS4B蛋白与STING相互作用的关键位点为NS2A L129、N130、L139、R140、F143和NS4B E2、M3、G4、W5、K10、D34、R36,并明确NS2A和NS4B免疫抑制功能促进着病毒基因组复制和增殖,发现NS2A L129和NS4B W5、D34位点的丙氨酸突变会减弱病毒感染和复制能力,降低其对鸭胚和雏鸭的致死力并下调病毒在脾脏中的病毒载量。同时,本论文探讨了NS2A和NS4B蛋白跨膜区的生物学特性及其调控病毒复制的机制,确定了NS2A和NS4B在内置网上的拓扑结构,并指出NS2A和NS4B蛋白TMD3跨膜区疏水性氨基酸是调控病毒复制的关键。本论文研究成果为理解DTMUV的增殖及其与宿主免疫互作提供理论依据。