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胞外囊泡(EV:Extracellular vesicles)是一种由细胞膜直接分泌或通过多囊泡体(Multivesicular Body,MVB)与细胞膜融合释放的、大小不均一的、膜包裹的球状小体,直径为30～5 000 nm。EV能选择性地包裹蛋白、脂质、核酸以及糖蛋白。动物EV在病原菌防御、介导机体的稳态平衡与生理功能调节以及自身免疫性疾病中发挥重要作用。植物EV对于small RNA(s RNA)的运输和病原物-寄主植物互作的过程至关重要。本课题主要研究植物病毒侵染植物时植物EV的作用。为探究植物EV在植物病毒侵染过程中的作用以及二者的互作机制,本研究以烟草坏死病毒A中国分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate,TNV-A)在本氏烟(Nicotiana benthamiana)植物叶片中的侵染作为研究模型,研究本氏烟EV包裹TNV-A全长RNA以及s RNA。首先我们利用透射电镜在本氏烟叶肉细胞质外体中观察到了囊泡状结构,直径约为25～250 nm。在本氏烟中分别瞬时表达模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的两个EV标记物蛋白GFP-AtPEN1与AtTET8-GFP以及一个MVB蛋白GFP-AtVPS4,发现GFP-AtPEN1表达稳定,能够作为本氏烟EV标记物。对本氏烟中富集到的EV进行碘克沙醇(Iodixanol)密度梯度离心,发现GFP-AtPEN1主要分布在碘克沙醇浓度为20%左右的组分中,与此前报道的拟南芥EV对应的密度基本一致。进一步通过透射电子显微镜观察TNV-A侵染的植物叶片的切片,发现TNVA促进了EV的分泌。我们提取了被病毒侵染的叶片中的EV组分,通过透射电子显微镜观察,证实了TNV-A的侵染增加了EVs的分泌约10倍。同时我们发现TNV-A的侵染增加了瞬时表达的EV标记物蛋白GFP-AtPEN1、AtTET8-GFP、大部分内体分拣转运复合体(Endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)蛋白以及定位于MVB上的RAB5蛋白的积累,并且TNV-A的侵染促进了GFP-AtPEN1、AtTET8-GFP、AtVPS25-GFP和AtVPS20.1-GFP在EV中的积累。接着,检测ESCRT或RAB蛋白的几个显性抑制突变体抑制TNV-A诱导的EV分泌的能力,发现AtVPS4-K178A、AtVPS4-E232Q和AtRAB6A-T23N突变体能够抑制GFP-AtPEN1分泌,说明TNV-A诱导的EV来自于MVB。接下来提取TNV-A诱导的EV的RNA进行s RNA测序,发现植物EV存在能够与TNVA基因组匹配的s RNA。同时将TNV-A诱导的EV进行碘克沙醇密度梯度离心,在EV中检测到TNV-A全长RNA,未检测到TNV-A病毒粒子。接着探究能够促进植物EV分泌的TNV-A组分,结果发现缺失运动蛋白MP(Movement protein)以及包装蛋白CP(Coat protein)的TNV-A-△MP-△CP侵染性克隆促进EV的分泌。瞬时表达TNV-A蛋白不能诱导植物EV的分泌,说明TNV-A复制水平促进植物EV分泌。为了探究植物EV在病毒侵染时的功能,将提取的TNV-A诱导的EV注射本氏烟,能够检测到少量的病毒CP的积累以及病毒RNA的复制。TNV-A病毒粒子与TNV-A诱导的EV共同接种本氏烟,发现EV能够延缓TNV-A在植物上的系统侵染,但对接种叶上的病毒复制没有影响。另外,表达ESCRT蛋白AtVPS4-K178A显性抑制突变体能够抑制病毒诱导的植物EV,并且可以抑制病毒在细胞内的扩散,但对已侵染的细胞中的病毒的复制没有影响。表明植物EV能够促进TNV-A的胞间运动。综上所述,本研究确定了拟南芥PEN1能够作为本氏烟胞外囊泡的标记物。TNV-A促进的植物EV包裹TNV-A正负链RNA,而不包裹病毒粒子。TNV-A诱导的EV可能起源于MVB,由于ESCRT参与病毒诱导的EV的形成。对TNVA诱导的EV功能研究发现EV能够促进病毒在接种叶的复制,并可能抑制病毒的系统性侵染。