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三线闭壳龟复合种(Cuora trifasciata Complex)包含3个外形上较为相似的物种:三线闭壳龟(Cuora trifasciata)、金头闭壳龟(Cuora aurocapitata)和潘氏闭壳龟(Cuora pani)。它们均分布于中国境内(越南可能有三线闭壳龟的分布,但未得到公认)。由于自然环境的变迁和人为因素的干扰,目前已导致这3个物种均濒临野生灭绝,因而被列为《濒危动物红色名录》极度濒危物种(IUCN,2012)。迄今,学者们虽通过形态学、少量线粒体和部分核基因的序列数据对三线闭壳龟复合种的种间关系进行过一些研究,但仍存在较多的争议,需要用更多的数据进行补充研究,以进一步阐明。 本研究采用PCR和LA-PCR技术,测序了三线闭壳龟的线粒体基因组全序列,结合本实验室之前测得的金头闭壳龟、潘氏闭壳龟的线粒体基因组全序列,比较分析了三线闭壳龟复合种的线粒体基因组DNA信息,结果显示:三线闭壳龟、金头闭壳龟和潘氏闭壳龟线粒体基因组全序列分别为16633bp( GenBank登录号为KC543355)、16890bp(AY874540)和16922bp(GQ889364)。均含有13个蛋白编码基因、2个rRNA和22个tRNA及1个非编码控制区(Control region,CR)。三种龟线粒体基因组的基因排列顺序完全一致,具有典型的脊椎动物线粒体基因组基因排列特征。其中,nd6蛋白编码基因由L链编码,其余12个蛋白编码基因均由H链编码;2个rRNA均由H链编码;tRNAPro、tRNAGlu、tRNASer(UCA)、tRNATyr、tRNACys、tRNAAsn、tRNAAla、tRNAGln8个tRNA基因由L链编码,其余14个基因均由H链编码。 比较分析三种龟线粒体基因组控制区(CR)的结构特征显示:三种龟的CR区均位于tRNApro和tRNAphe之间,长度分别为1113bp、1379bp和1402bp;均含有终止相关序列( termination associated sequence, TAS)、中央保守区(central conserved sequence block, CD)和保守序列区(conserved sequence blocks, CSB);在3’末端还含有可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeats, VNTR),也称微卫星(microsatellites)序列。三种龟共有3种类型的 VNTR(TATTA、TATTATAT和 TA)。其中,三线闭壳龟含有 TATTA和TA两种,分别重复42次和7次;金头闭壳龟和潘氏闭壳龟都含有TATTATAT和TA两种相同类型,分别重复48次、64次和5次、2次。因为有相同类型的VNTR,推测金头闭壳龟和潘氏闭壳龟有更近的亲缘关系;从基序类型的变异看,TATTATAT和TA可能是由三线闭壳龟的TATTA复制为TATTATATTA再进行删减而得到,推测三线闭壳龟有着更早的起源。本文基于线粒体全序列数据计算了三线闭壳龟复合种及其近缘闭壳龟物种和外群(里海拟水龟(Mauremys caspica)、乌龟(Mauremys reevesii))的遗传距离,结果显示在三线闭壳龟复合种中,金头闭壳龟和潘氏闭壳龟的遗传距离0.01109明显小于它们与三线闭壳龟的遗传距离0.03828和0.03005。本研究还测序了三线闭壳龟复合种及其他6种闭壳龟类物种的16个核基因序列,它们分别是 RAG-1、RAG-2、REELIN、R35、GAPDH、C-mos、HNF-1ɑ、BDNF、ADNP、AHR、FSTL5、NGF、PAX1P1、ZEB2、CLOCK和TRAF基因,并结合NCBI上的BMP2、HMGB2和P26S4基因,合并比对19个核基因序列数据,获得的联合数据长为16639bp,其中可变位点1693bp,简约信息位点287bp。基于19个核基因中的8个内含子联合序列数据计算了11个物种的遗传距离,结果显示金头闭壳龟和潘氏闭壳龟的遗传距离0.00449小于黄额闭壳龟两亚种布氏闭壳龟和图画闭壳龟的遗传距离0.00591,推测金头闭壳龟和潘氏闭壳龟为亚种水平的分化。用里海拟水龟(M. caspica)和乌龟(M. reevesii)作为外群,基于线粒体全序列、8个核基因内含子序列以及线粒体全序列和19个核基因的联合序列数据,采用最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)构建系统发育树。两种方法构建的三线闭壳龟复合种的拓扑结构一致,金头闭壳龟和潘氏闭壳龟亲缘关系更近,它们组成的姐妹群(支持率为100％)与三线闭壳龟聚为姐妹群(支持率为100%)。金头闭壳龟和潘氏闭壳龟分化的节点晚于黄额闭壳龟两亚种布氏闭壳龟和图画闭壳龟的分化节点,推测金头闭壳龟和潘氏闭壳龟为亚种水平的分化。三线闭壳龟和金头闭壳龟、潘氏闭壳龟的分化节点早于有效种黑腹闭壳龟和它的两个亚种布氏闭壳龟、图画闭壳龟的分化节点,推测三线闭壳龟为有效种。 基于上述的研究结果,本研究认为在三线闭壳龟复合种中,三线闭壳龟为有效种,而金头闭壳龟和潘氏闭壳龟为亚种水平的分化,建议为三线闭壳龟的亚种。