【摘 要】
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背景:恶性肿瘤目前已成为全世界死亡的主要原因和重大公共卫生问题,了解肿瘤的分子机制对于改善诊断和治疗至关重要。恶性肿瘤的发生是多基因、多步骤累积突变造成的,肿瘤的发生目前有两种理论,分别是主效基因决定论和微效基因累加理论。在肿瘤突变中发生频率较高的是点突变,其中一般认为能够引起显著功能改变的是错义突变。根据主效基因决定论,错义突变有可能直接导致严重后果,也有可能基于微效位点累加理论引起微效型的功能
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背景:恶性肿瘤目前已成为全世界死亡的主要原因和重大公共卫生问题,了解肿瘤的分子机制对于改善诊断和治疗至关重要。恶性肿瘤的发生是多基因、多步骤累积突变造成的,肿瘤的发生目前有两种理论,分别是主效基因决定论和微效基因累加理论。在肿瘤突变中发生频率较高的是点突变,其中一般认为能够引起显著功能改变的是错义突变。根据主效基因决定论,错义突变有可能直接导致严重后果,也有可能基于微效位点累加理论引起微效型的功能改变,目前对于单位点的错义突变能否引起基因功能的改变及改变程度的评估是亟需完善和解决的问题,建立更加科学有效的基因点突变相关的功能研究平台与技术成为了肿瘤等疾病研究的重要挑战。CRISPR/Cas9是近年来用于基因编辑的前沿方法,通过此技术靶向修饰驱动肿瘤发生发展的主效基因或将成为疾病治疗的有效方法,但关于其安全性及使用标准等还没有一个系统性、规范性的评估,因此我们通过CRISPR/Cas9技术在体外构建了人肺癌A549与乳腺癌MCF-7的点突变细胞系,并通过进一步的功能验证来初步探索此技术对点突变功能研究的作用,希望可以为CRISPR/Cas9技术的应用等奠定一定基础。研究方法:1.设置肿瘤突变基因及位点的筛选条件:突变基因应为肿瘤中的热点突变,在肿瘤发生发展中发挥重要驱动作用;且已有研究证明,此突变基因与突变位点可引起明显的肿瘤恶性表型。2.构建CRISPR/Cas9系统:设计、合成目标序列对应的sg RNA及同源重组模板oligo donor DNA,连同Cas9核酸酶一起通过电转染的方式导入目标细胞系,使目标序列DNA双链断裂,并诱发胞内进行同源重组修复,从而实现对两种细胞的点突变编辑。3.单克隆细胞的培养:转染后的细胞经过分选后获得单克隆,进一步扩大培养,提取基因组DNA并通过PCR扩增、测序验证细胞突变位点及突变基因型。4.以质粒转染引入外源点突变的细胞为对照,通过CCK8增殖实验、Transwell小室迁移实验、细胞凋亡及周期检测研究CRISPR/Cas9技术的有效性等,并对这两种技术进行相关比较。结果:1.根据筛选条件选择了肿瘤的热点突变基因TP53,通过分析确定了TP53 exon8为目标序列,p.R273H为需要靶向的突变位点。2.成功将CRISPR/Cas9系统导入了细胞。单克隆细胞在培养后提取基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳显示出现了目的条带,测序结果显示,单克隆细胞在目标位点发生了突变,突变基因型为杂合突变。3.通过CRISPR/Cas9技术诱发点突变后,可显著提高A549细胞与MCF-7细胞的增殖、迁移能力,诱发周期变化,抑制细胞凋亡。且转染野生型质粒可部分恢复点突变导致的细胞功能变化。4.CRISPR/Cas9技术可直接对内源基因进行靶向点突变修饰,较质粒转染来说稳定性更高,实验重复性较好。结论:通过CRISPR/Cas9技术成功构建了TP53 R273H点突变的A549细胞与MCF-7细胞,功能实验表明TP53基因点突变后可显著提高细胞的增殖、迁移能力,诱发周期变化,抑制细胞凋亡。且Rescue实验表明转染野生型质粒后可部分恢复点突变导致的细胞功能变化。CRISPR/Cas9技术较质粒转染来说稳定性更高,实验重复性较好,这暗示通过CRISPR/Cas9技术构建与疾病对应的点突变模型具有一定的可行性,但此技术的广泛应用仍需要不断地探索与优化。
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