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益生乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)菌体较大,不存在内毒素,可以吸附黏膜细胞上并定居于黏膜表层。因此,乳酸菌是表达和传递治疗性和预防性外源蛋白的首选载体。禽β-防御素(AvBDs)是主要存在于天然黏膜系统的天然抗菌肽之一,主要发挥抗感染、广谱抗菌和广泛的免疫调节作用,特别是禽β-防御素是一种小的阳离子非糖基化的多肽,非常适合于原核表达。因此,本研究采用食品级乳酸乳球菌NZ3900宿主菌株,构建了完全食品级表达禽β-防御素的重组乳酸菌。本研究利用3种表达质粒和食品级宿主菌株构建了3套表达禽β-防御素的重组乳酸菌。采用的3种表达系统和食品级乳酸乳球菌NZ3900菌株作为宿主菌株,分别构建了表达禽β-防御素1(AvBD1)、禽β-防御素2(AvBD2)、禽β-防御素6(AvBD6)、禽β-防御素13(AvBD13)和融合禽β-防御素1/2/6/13功能片段组成的融合禽β-防御素AvBD12613,共11株重组乳酸菌,其中5株重组乳酸菌的表达量稳定,蛋白大小正确,是本研究用于体外筛选和体内动物试验验证的重组乳酸菌。利用表达β-防御素的重组乳酸菌的菌体裂解混合物体与巨噬细胞、外周血单个核细胞等的相互作用,对构建的重组乳酸菌体外免疫调节活性的检测,体外筛选试验结果表明,表达禽β-防御素的重组乳酸菌r-L.Lactis-AvBD12613菌体裂解混合物可以显著激活巨噬细胞报告细胞系J774-Dual?细胞的IRF及NF-κB信号通路;5种表达重组禽β-防御素rAvBD1、rAvBD2、rAvBD6、rAvBD13及rAvBD12613重组乳酸菌菌体裂解混合物均能够诱导鸡巨噬细胞系HD11产生较高水平的IL-10;其中rAvBD12613还能够诱导HD11表达较高水平的CD80和CD86分子;而重组禽β-防御素rAvBD12613、rAvBD1及rAvBD6能够诱导鸡外周血单个核细胞(PBMCs)产生较高水平的IL-12与IL-10;并且rAvBD12613还能诱导鸡PBMCs表达较高水平的CD80和CD86分子,体外筛选表明,表达重组禽β-防御素rAvBD12613重组乳酸菌具有较强的免疫调节活性。利用表达组合禽β-防御素rAvBD12613重组乳酸菌的菌体裂解混合物作为新城疫活疫苗和新城疫灭活疫苗的免疫佐剂,通过检测血清中细胞因子表达水平,PBMCs和外周血白细胞的增殖活性以及抗体水平等方式来验证组合禽β-防御素rAvBD12613的免疫佐剂活性。动物实验结果表明:在重组禽β-防御素rAvBD12613免疫佐剂活疫苗试验中,注射免疫1周后,显著提高了实验组鸡血清中IL-4和IL-1β表达水平,而IL-10和IFN-γ在血清中的表达水平差异不显著;与野生菌对照组和活疫苗对照组相比,在免疫3周攻毒1周后,显著提高了实验组的抗体水平;免疫3周及攻毒1周后,极显著提高了实验组鸡PBMCs的增殖活性;免疫1周及攻毒1周后,显著提高了实验组鸡PBMCs的增殖活性。而在鸡新城疫重组禽β-防御素rAvBD12613免疫佐剂油乳剂灭活疫苗试验中,在免疫3周攻毒1周后,可以显著提高实验组的抗体水平;免疫3周及攻毒1周后,可以显著提高实验组鸡PBMCs和白细胞的增殖活性,显著高于灭活疫苗对照组。结果表明,重组禽β-防御素rAvBD12613免疫佐剂在新城疫活疫苗和灭活疫苗试验中均具有较好的免疫佐剂活性。本研究构建表达的重组禽β-防御素rAvBD12613在体内外均显示了较强的免疫调节活性,具有作为免疫佐剂或免疫增强剂的潜力,为新型食品安全级动物免疫佐剂或免疫增强剂的研发奠定了基础。